Caracterização Molecular E Bioquímica De Variantes De Oxa-50 Em Isolados De Pseudomonas Aeruginosa
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Data
2017-04-10
Autores
Oliveira, Ana Paula Streling De [UNIFESP]
Orientadores
Gales, Ana Cristina [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
ABSTRACT Along with AmpC and PIB, OXA-50 enzymes are chromosomal β-lactamases intrinsically found in Pseudomonas aeruginosa. Herein, we aimed to characterize the biochemical properties and genetic environment of OXA-50 variants from P. aeruginosa isolates. An initial β-lactamase screening demonstrated that Pb9 harbored the chromosomal encoded blaOXA-488 and ampC genes. The carbapenem-susceptible PA01 and the carbapenem-resistant P1088 (blaSPM-1+) strains, which carry blaOXA-50 and blaOXA-494, respectively, were also included in this study for comparison analysis. The genetic environments of blaOXA-50-like of Pb9 and P1088 were sequenced and compared to that of PA01. The PCR amplicons of the entire blaOXA-50-like gene were cloned into pET-26b+ vector and the recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli strain DH5α, and subsequently expressed into E. coli strain BL21 after incubation on LB agar plates containing 50 μg/mL kanamycin. The transformant strains had their β-lactam MICs determined by Etest®. Expression of OXA-50 enzymes was induced by overnight incubation in 1 L of LB broth containing 0.25 mM IPTG at 20°C. The β-lactamases were released from the periplasm by osmotic shock and purified by molecular exclusion and ion-exchange chromatography. For an initial screening, the presence of a degradation product from the hydrolysis of 10 β-lactams was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC). Kinetics assays were performed only for the antimicrobials that showed positive hydrolysis in HPLC assay. The transcription of mexB, mexD, mexF and mexY, ampC poxA, poxB and oprD was assessed by qRT-PCR. OXA-488 and OXA-494 differ from OXA-50 in three (Gly14Ala, Thr16Ala, Arg49Leu) and two (Asp109Glu and Arg167His) amino acids, respectively. All blaOXA-50-like genes were flanked upstream by poxA and downstream by ORF coding for a hypothetical protein of 407 bp. Considering the absence of promoter-like sequences in the intergenic region, and the presence of a potential ρ-independent terminator downstream of blaOXA-50-like, we hypothesized that these genes form a two-gene operon (poxAB). Mutations in poxA were found in P1088 (Phe7Ser, Ala50Thr and Thr232IIe) and Pb9 (Phe7Ser and Asp279Ala). HPLC assay demonstrated that all OXA-50 variants were able to hydrolyze penicillin, ampicillin, oxacillin, ticarcillin e imipenem in vitro. In contrast, the MICs for carbapenems and benzylpenicillins of transformants did not differ from those observed for wild-type BL21 strain. Kinetics assays demonstrated that all enzymes present a good catalytic efficiency against benzylpenicillin and oxacillin, but not against ticarcillin. Among the OXA-50 variants, OXA-488 showed the strongest activity against imipenem. The efflux systems MexAB-OprM and MexXY-OprM were overexpressed in Pb9 (3.06 folds) and P-1088 (16.48 folds), respectively. Regarding the poxAB operon, poxB presented increased expression of ~4x and ~3x for Pb9 and P1088, respectively, but only a 1.18 e 1.13 fold change in poxA transcription was observed for those strains. Our results showed that OXA-50 enzymes can hydrolyze imipenem, but not meropenem, ticarcillin and extended-spectrum cephalosporin. In addition, the low MICs for carbapenems verified for the transformant strains demonstrated that the genetic background (poxA) of blaOXA-50-like genes could have contributed for theoverexpression of such enzymes.
RESUMO As enzimas do tipo OXA-50 representam um grupo de oxacilinases cromossômicas intrínsecas de Pseudomonas aeruginosa. No presente estudo, caracterizamos as propriedades bioquímicas e moleculares de três variantes de OXA-50 isoladas de P. aeruginosa. Foram selecionadas três cepas, sendo estas: Pb9 (blaOXA-488) - cepa clínica apresentando um fenótipo raro e emergente de resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro (ESCph); P-1088 (blaOXA-494) - primeiro isolado produtor de SPM-1; e PA01 cepa carreadora do gene blaOXA-50 original utilizada também como controle nos ensaios de qRT-PCR. O contexto genético do blaOXA-50-like da Pb9 e P-1088 foram sequenciados e comparados com a PA01. Os fragmentos gerados pela reação de PCR do gene blaOXA-50-like foram clonados no vetor pET-26b+ e os plasmídeos recombinantes foram expressos em cepas de Escherichia coli BL21 (placas de LB ágar + 50 μg/mL de canamicina). As CIMs para os clones transformantes foram determinados por Etest®. A produção da OXA-50 e de suas variantes foram induzidas em 1 L de caldo LB suplementado com 0.25 mM de IPTG e incubados durante a noite à 20°C. As β- lactamases foram liberadas do espaço periplasmático por choque osmótico e purificadas por cromatografia de exclusão molecular e troca iônica. Para a triagem inicial da hidrólise das enzimas frente aos β-lactâmicos foi realizada a cromatografia de alta eficiência (HPLC) para 10 diferentes antimicrobianos usando uma coluna C18 de 1 mL através de um gradiente linear de acetonitrila. Os ensaios cinéticos foram realizados apenas para os antimicrobianos que apresentaram hidrólise positiva no HPLC. Os níveis transcricionais dos genes mexB, mexD, mexF and mexY, ampC, poxA, poxB e oprD foram avaliados pela técnica de qRT-PCR. A OXA-488 e a OXA-494 diferem da OXA-50 em três (Gly14Ala, Thr16Ala, Arg49Leu) e dois aminoácidos (Asp109Glu and Arg167His), respectivamente. Todos os genes blaOXA-50-like avaliados eram flanqueados a montante pelo gene poxA e a jusante por uma ORF que codifica uma proteína hipotética de 407 bp. A falta de uma região promotora na região intergênica, e a presença de uma região ρ-terminadora a montante do gene blaOXA-50-like, indicam que estes genes formam um operon (poxAB). Mutações no gene poxA foram encontrados nas cepas P1088 (Phe7Ser, Ala50Thr and Thr232IIe) e Pb9 (Phe7Ser and Asp279Ala). A análise realizada por HPLC demonstrou que todas as variantes de OXA-50 foram capazes de hidrolisar benzilpenicilina, ampicilina, oxacilina, ticarcilina e imipenem. No entanto, as CIMs para benzilpenicilina e carbapenêmicos não demonstraram diferenças quando comparadas à cepa selvagem BL21 para os clones transformantes. Em concordância com os dados do HPLC, os ensaios cinéticos demonstraram boa eficiência catalítica das enzimas testadas frente à benzilpenicilina e à oxacilina. Entretanto, todas as variantes de OXA-50 avaliadas não hidrolisam ticarcilina eficientemente. Entre as variantes avaliadas, a OXA-488 demonstrou melhor atividade catalítica frente ao imipenem. Os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM estavam hiperexpressos nas cepas Pb9 (3,06 vezes) e P1088 (16,48 vezes), respetivamente. Embora aexpressão dos genes blaOXA-488 e blaOXA-494 estivesse aumentado de ~4x e ~3x em relação ao gene blaOXA-50, seus respectivos genes poxA tiveram a expressão aumentada em apenas 1,18 e 1,13 vezes. Nossos resultados demostraram que a OXA-50 e suas variantes podem hidrolisar imipenem, mas não meropenem, ticarcilina e ESCph. Além disso, as baixas CIMs para os carbapenêmicos verificadas entre os clones transformantes podem ser devido ao hospedeiro utilizado no ensaio de transformação.
RESUMO As enzimas do tipo OXA-50 representam um grupo de oxacilinases cromossômicas intrínsecas de Pseudomonas aeruginosa. No presente estudo, caracterizamos as propriedades bioquímicas e moleculares de três variantes de OXA-50 isoladas de P. aeruginosa. Foram selecionadas três cepas, sendo estas: Pb9 (blaOXA-488) - cepa clínica apresentando um fenótipo raro e emergente de resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro (ESCph); P-1088 (blaOXA-494) - primeiro isolado produtor de SPM-1; e PA01 cepa carreadora do gene blaOXA-50 original utilizada também como controle nos ensaios de qRT-PCR. O contexto genético do blaOXA-50-like da Pb9 e P-1088 foram sequenciados e comparados com a PA01. Os fragmentos gerados pela reação de PCR do gene blaOXA-50-like foram clonados no vetor pET-26b+ e os plasmídeos recombinantes foram expressos em cepas de Escherichia coli BL21 (placas de LB ágar + 50 μg/mL de canamicina). As CIMs para os clones transformantes foram determinados por Etest®. A produção da OXA-50 e de suas variantes foram induzidas em 1 L de caldo LB suplementado com 0.25 mM de IPTG e incubados durante a noite à 20°C. As β- lactamases foram liberadas do espaço periplasmático por choque osmótico e purificadas por cromatografia de exclusão molecular e troca iônica. Para a triagem inicial da hidrólise das enzimas frente aos β-lactâmicos foi realizada a cromatografia de alta eficiência (HPLC) para 10 diferentes antimicrobianos usando uma coluna C18 de 1 mL através de um gradiente linear de acetonitrila. Os ensaios cinéticos foram realizados apenas para os antimicrobianos que apresentaram hidrólise positiva no HPLC. Os níveis transcricionais dos genes mexB, mexD, mexF and mexY, ampC, poxA, poxB e oprD foram avaliados pela técnica de qRT-PCR. A OXA-488 e a OXA-494 diferem da OXA-50 em três (Gly14Ala, Thr16Ala, Arg49Leu) e dois aminoácidos (Asp109Glu and Arg167His), respectivamente. Todos os genes blaOXA-50-like avaliados eram flanqueados a montante pelo gene poxA e a jusante por uma ORF que codifica uma proteína hipotética de 407 bp. A falta de uma região promotora na região intergênica, e a presença de uma região ρ-terminadora a montante do gene blaOXA-50-like, indicam que estes genes formam um operon (poxAB). Mutações no gene poxA foram encontrados nas cepas P1088 (Phe7Ser, Ala50Thr and Thr232IIe) e Pb9 (Phe7Ser and Asp279Ala). A análise realizada por HPLC demonstrou que todas as variantes de OXA-50 foram capazes de hidrolisar benzilpenicilina, ampicilina, oxacilina, ticarcilina e imipenem. No entanto, as CIMs para benzilpenicilina e carbapenêmicos não demonstraram diferenças quando comparadas à cepa selvagem BL21 para os clones transformantes. Em concordância com os dados do HPLC, os ensaios cinéticos demonstraram boa eficiência catalítica das enzimas testadas frente à benzilpenicilina e à oxacilina. Entretanto, todas as variantes de OXA-50 avaliadas não hidrolisam ticarcilina eficientemente. Entre as variantes avaliadas, a OXA-488 demonstrou melhor atividade catalítica frente ao imipenem. Os sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM estavam hiperexpressos nas cepas Pb9 (3,06 vezes) e P1088 (16,48 vezes), respetivamente. Embora aexpressão dos genes blaOXA-488 e blaOXA-494 estivesse aumentado de ~4x e ~3x em relação ao gene blaOXA-50, seus respectivos genes poxA tiveram a expressão aumentada em apenas 1,18 e 1,13 vezes. Nossos resultados demostraram que a OXA-50 e suas variantes podem hidrolisar imipenem, mas não meropenem, ticarcilina e ESCph. Além disso, as baixas CIMs para os carbapenêmicos verificadas entre os clones transformantes podem ser devido ao hospedeiro utilizado no ensaio de transformação.