Avaliação Da Atividade Do Amblyomin-X Na Regulação Da Adesão E Migração De Células Endoteliais E Tumorais São Paulo,
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Data
2017-02-24
Autores
Schmidt, Mariana Costa Braga [UNIFESP]
Orientadores
Tavassi, Ana Marisa Chudzinski [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Amblyomin-X is a Kunitz-type protease inhibitor that promotes phospholipids-dependent inhibition of FXa, or inhibits the activation of FX through TF/FVlla complex. This recombinant protein shows similarity with Kunitz domain of TFPI-1 and -2, that are endogenous regulators of coagulation process and has anti-tumor activity. On previous studies, Amblyomin-X showed anti-tumor effects, besides regulation of development and progression tumor process, like coagulation and angiogenesis. Furthermore, this molecule possesses cytotoxic activity associated to proteasome, endoplasmic reticulum stress, mitochondria dysfunction and caspase activation. However, the same didn't occur on normal cells like fibroblast, suggesting that this protease has selective cytotoxic activity on tumor cells. Although the advances were made in pro-apoptotic signaling on tumor cells, it is not yet elucidated Amblyomin-X action on pericelular proteolysis and extracellular matrix remodeling, important process on progression and metastasis tumor. After treatment of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and melanoma (SK-MEL-28) and pancreas adenocarcinoma (MIA PaCa'~2) tumor cells with Amblyomin-X in an isolated or a conjunct way with inhibitors antiuPAR, Exo 1 (exocytosis) ou HPI-4 (dynein), we analyzed cell viability (MTT), quantified uPA and PAI-1 liberation (ELlSA), cytoskeleton (faloidin), migration (IN Cell), MMPs liberation (zymography) and uPAR, RhoA and Rac 1 expression (Western Blot). The results showed that Amblyomin-X has not cytotoxic effects ou induce cytoskeleton modification on HUVECs, but intensify interaction between uPAR and co-receptors, increasing adhesion and reducing migration of these cells. Though, tumor cells exhibit viability depletion, cytoskeleton and migration regulation by Amblyomin-X by different forms, decreasing Rho GTPase expression or reducing pericelular proteases and MMPs liberation. Besides that, Amblyomin-X reversed alterations promoted by uPAR antibody or exocytosis inhibition, which suggests a common pathway between Amblyomin-X and uPAR. Considering this data, we can affirm that Amblyomin-X has selectivity cytotoxic activity on tumor cells and regulate different pathways on tumor and endothelial cells that inhibits cell migration. Differently, bortezomib, an antitumor drug used in distinct cancer treatments, has harmful action on tumor and endothelial cells, which generates side effects discussed on literature. Therefore, the results showed on this work provides significant information about cytotoxic effects and regulation of migration activity by Amblyomin-X, which are important process to reduce growth and metastasis tumor, and give expectations to new studies in this subject.
o Amblyomin-X é um inibidor de proteases do tipo Kunitz capaz de inibir o FXa em presença de fosfolipídios ou de inibir a ativação do FX por meio do complexo FT/FVlla. Essa proteína recombinante apresenta similaridade com o domínio Kunit do TFPI-1 e -2, reguladores endógenos do processo de coagulação e que têm ação antitumoral. Em estudos prévios, foi visto que o Amblyomin-X possui efeitos antitumorais, além de regular fatores que envolvem tanto a coagulação, quanto a angiogênese, processos extremamente importantes no desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, essa molécula possui atividade citotóxica associada à inibição do proteassoma, com o estresse do retículo endoplasmático, disfunção mitocondrial e ativação de caspases. Porém, o mesmo não foi visto em fibroblastos, sugerindo que essa protease possui atividade citotóxica seletiva em células tumorais. Apesar dos avanços no estudo da sinalização pró-apoptótica induzida pelo Amblyomin-X em células tumorais, ainda não está totalmente esclarecida a sua ação sobre a proteólise pericelular e o remodelamento da matriz extracelular (MEC), que ."~ são processos importantes por estarem intimamente relacionados com a interação entre o endotélio vascular, a progressão tumoral e a metástase. Após tratamento das células endoteliais (HUVECs) e tumorais de melanoma (SK-MEL-28) e adenocarcinoma de pâncreas (MIA PaCa-2) com Amblyomin-X de forma isolada ou simultaneamente com inibidores de exocitose (Exo 1), dineína (HPI-4) ou anti-uPAR, analisamos a viabilidade celular através de ensaios de MTT, quantificamos por ELlSA a liberação de proteases uPA e PAI-1, verificamos o citoesqueleto de actina através de sua marcação com faloidina, analisamos a migração no IN Cell, verificamos a liberação de MMPs por ensaio de zimografia e a expressão de uPAR, RhoA e Rac 1 por ensaios de Western Blot. Os resultados mostram que o Amblyomin- X não possui atividade citotóxica e não altera o citoesqueleto em HUVECs, mas regula sua adesão ao fortalecer a interação entre uPAR eco-receptores, diminuindo, assim, sua migração. Em compensação, as células tumorais apresentaram diminuição de suas viabilidades e regulação do citoesqueleto e da migração por diferentes vias, ou diminuindo a expressão de Rho GTPases, ou reduzindo a liberação de proteases pericelulares e MMPs. Além disso, o Amblyomin-X foi capaz de reverter alterações promovidas após bloqueio de uPAR e inibição da exocitose, indicando possuir uma via em comum com esse receptor. Em vista disso, podemos afirmar que o Amblyomin-X possui citotoxicidade seletiva em células tumorais e regula diferentes vias entre células não tumorais e tumorais que levam à inibição da migração celular. Diferentemente, o bortezomibe, um antitumoral aplicado no tratamento de diversos tipos de câncer, possui atividade prejudicial inclusive em células normais, o que provoca os efeitos colaterais descritos na literatura. Assim, os resultados apresentados nesse trabalho fornecem informações importantes tanto a respeito da citotoxicidade do Amblyomin-X em células endoteliais e tumorais quanto em relação à sua atividade na regulação da migração dessas células, importante no combate ao crescimento e metástase tumoral, o que gera expectativas para novos estudos.
o Amblyomin-X é um inibidor de proteases do tipo Kunitz capaz de inibir o FXa em presença de fosfolipídios ou de inibir a ativação do FX por meio do complexo FT/FVlla. Essa proteína recombinante apresenta similaridade com o domínio Kunit do TFPI-1 e -2, reguladores endógenos do processo de coagulação e que têm ação antitumoral. Em estudos prévios, foi visto que o Amblyomin-X possui efeitos antitumorais, além de regular fatores que envolvem tanto a coagulação, quanto a angiogênese, processos extremamente importantes no desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, essa molécula possui atividade citotóxica associada à inibição do proteassoma, com o estresse do retículo endoplasmático, disfunção mitocondrial e ativação de caspases. Porém, o mesmo não foi visto em fibroblastos, sugerindo que essa protease possui atividade citotóxica seletiva em células tumorais. Apesar dos avanços no estudo da sinalização pró-apoptótica induzida pelo Amblyomin-X em células tumorais, ainda não está totalmente esclarecida a sua ação sobre a proteólise pericelular e o remodelamento da matriz extracelular (MEC), que ."~ são processos importantes por estarem intimamente relacionados com a interação entre o endotélio vascular, a progressão tumoral e a metástase. Após tratamento das células endoteliais (HUVECs) e tumorais de melanoma (SK-MEL-28) e adenocarcinoma de pâncreas (MIA PaCa-2) com Amblyomin-X de forma isolada ou simultaneamente com inibidores de exocitose (Exo 1), dineína (HPI-4) ou anti-uPAR, analisamos a viabilidade celular através de ensaios de MTT, quantificamos por ELlSA a liberação de proteases uPA e PAI-1, verificamos o citoesqueleto de actina através de sua marcação com faloidina, analisamos a migração no IN Cell, verificamos a liberação de MMPs por ensaio de zimografia e a expressão de uPAR, RhoA e Rac 1 por ensaios de Western Blot. Os resultados mostram que o Amblyomin- X não possui atividade citotóxica e não altera o citoesqueleto em HUVECs, mas regula sua adesão ao fortalecer a interação entre uPAR eco-receptores, diminuindo, assim, sua migração. Em compensação, as células tumorais apresentaram diminuição de suas viabilidades e regulação do citoesqueleto e da migração por diferentes vias, ou diminuindo a expressão de Rho GTPases, ou reduzindo a liberação de proteases pericelulares e MMPs. Além disso, o Amblyomin-X foi capaz de reverter alterações promovidas após bloqueio de uPAR e inibição da exocitose, indicando possuir uma via em comum com esse receptor. Em vista disso, podemos afirmar que o Amblyomin-X possui citotoxicidade seletiva em células tumorais e regula diferentes vias entre células não tumorais e tumorais que levam à inibição da migração celular. Diferentemente, o bortezomibe, um antitumoral aplicado no tratamento de diversos tipos de câncer, possui atividade prejudicial inclusive em células normais, o que provoca os efeitos colaterais descritos na literatura. Assim, os resultados apresentados nesse trabalho fornecem informações importantes tanto a respeito da citotoxicidade do Amblyomin-X em células endoteliais e tumorais quanto em relação à sua atividade na regulação da migração dessas células, importante no combate ao crescimento e metástase tumoral, o que gera expectativas para novos estudos.