Avaliação de peptídeos sintéticos selecionados por phage display para o sorodiagnóstico da Paracoccidioidomicose
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Data
2017-06-29
Autores
Portes, Leticia da Silva [UNIFESP]
Orientadores
Xander, Patricia [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Paraccocidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the thermo-dimorphic fungus from complex Paraccocidioides. The disease diagnosis uses both direct detection of the fungus in biological samples and serological tests, which have also important role to follow disease progression and response to treatment. Currently, the use of synthetic peptides in the serological diagnosis of infectious diseases may represents a valuable strategy since, in comparison with natural or recombinant antigens, assays using these molecules are cheaper, simple, reproducible, and in some cases more specific and sensitive. Thus, the aim of this study was to screen and to identify peptides reactive against sera from patients with PCM by using Phage Display approach. First, a selection using immunoglobulins purified from sera of individuals without PCM (normal) were performed to eliminate phages clones not specific to the fungus. Then, positive selection was carried out against immunoglobulins purified from pool of sera from patients with PCM. The binding-phages were sequenced and tested in a binding assay to evaluate the interaction between the selected phages and the sera of normal individuals and patients with PCM. LP2 and LP15 samples showed higher affinity with sera of patients with PCM, compared to normal sera. The synthetic peptides were tested by ELISA and the LP15 peptide was recognized by sera of patients with PCM. The detection was higher when we used a mixture of LP15 and P2 peptide (mimetope of gp75 of P. brasiliensis). Thus, the Phage Display technology were useful to identify peptides with potential applications in PCM serodiagnosis.
Paraccocidioidomicose (PCM) é doença granulomatosa sistêmica causada pelo fungo termo-dimórfico do complexo Paraccocidioides. O diagnóstico da doença envolve métodos diretos de detecção da presença do fungo em amostras de escarro e biópsia de tecido assim como testes sorológicos, os quais auxiliam no diagnóstico, no monitoramento da evolução da doença e na resposta ao tratamento. A utilização de peptídeos sintéticos no sorodiagnóstico de doenças infecciosas pode representar uma estratégia muito valiosa uma vez que, em comparação aos antígenos naturais ou recombinantes, os ensaios utilizando essas moléculas podem ter custo menor, são de simples execução, reprodutíveis, e, em alguns casos, mais específicos e sensíveis. Assim, o objetivo desse trabalho foi selecionar e identificar peptídeos reativos contra soros de pacientes com PCM utilizando a estratégia de Phage Display de peptídeos. Primeiramente, foi realizada pré-seleção utilizando pool de imunglobulinas purificadas de soros de indivíduos sem PCM (normal), para eliminar fagos que não são específicos para o fungo. Após essa subtração, a bibioteca foi submetida à seleção positiva contra pool de imunglobulinas purificadas de soros de pacientes com PCM. Os fagos ligantes foram sequenciados e testados em ensaio de ligação, para avaliar a interação entre os fagos selecionados e os soros de indivíduos normais e pacientes com PCM. As amostras LP2 e LP15 apresentaram afinidade maior com o soro de pacientes com PCM em relação ao soro de indivíduos normais. Os peptídeos expressos pelos fagos LP15 e LP2 foram sintetizados e testados por ELISA para avaliar sua especificidade por soros de pacientes com PCM. O peptídeo LP15 apresentou maior especificidade por soros de pacientes de PCM e essa detecção foi potencializada quando testado em conjunto com peptídeo P2 (mimetopo da gp75 de P. brasiliensis). Assim, a estratégia de Phage Display se mostrou eficaz para identificar peptídeos que podem ser utilizados para o sorodiagnóstico da PCM.
Paraccocidioidomicose (PCM) é doença granulomatosa sistêmica causada pelo fungo termo-dimórfico do complexo Paraccocidioides. O diagnóstico da doença envolve métodos diretos de detecção da presença do fungo em amostras de escarro e biópsia de tecido assim como testes sorológicos, os quais auxiliam no diagnóstico, no monitoramento da evolução da doença e na resposta ao tratamento. A utilização de peptídeos sintéticos no sorodiagnóstico de doenças infecciosas pode representar uma estratégia muito valiosa uma vez que, em comparação aos antígenos naturais ou recombinantes, os ensaios utilizando essas moléculas podem ter custo menor, são de simples execução, reprodutíveis, e, em alguns casos, mais específicos e sensíveis. Assim, o objetivo desse trabalho foi selecionar e identificar peptídeos reativos contra soros de pacientes com PCM utilizando a estratégia de Phage Display de peptídeos. Primeiramente, foi realizada pré-seleção utilizando pool de imunglobulinas purificadas de soros de indivíduos sem PCM (normal), para eliminar fagos que não são específicos para o fungo. Após essa subtração, a bibioteca foi submetida à seleção positiva contra pool de imunglobulinas purificadas de soros de pacientes com PCM. Os fagos ligantes foram sequenciados e testados em ensaio de ligação, para avaliar a interação entre os fagos selecionados e os soros de indivíduos normais e pacientes com PCM. As amostras LP2 e LP15 apresentaram afinidade maior com o soro de pacientes com PCM em relação ao soro de indivíduos normais. Os peptídeos expressos pelos fagos LP15 e LP2 foram sintetizados e testados por ELISA para avaliar sua especificidade por soros de pacientes com PCM. O peptídeo LP15 apresentou maior especificidade por soros de pacientes de PCM e essa detecção foi potencializada quando testado em conjunto com peptídeo P2 (mimetopo da gp75 de P. brasiliensis). Assim, a estratégia de Phage Display se mostrou eficaz para identificar peptídeos que podem ser utilizados para o sorodiagnóstico da PCM.