Estudo da homeostase lisossômica e caracterização de fibroblastos de pacientes com doença de Fabry em cultura celular

Abstract

Fabry disease is one of the lysosomal storage diseases which has a X-linked recessive inheritance. A mutation in GLA gene, causes α-galactosidase A (α-Gal A) deficiency, that with the crescent accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) results in signs and symptoms. This is a chronic disease, and the vascular endothelial cells are the most compromised, leading to a multiorgan disease, with some neurologic manifestations that can cause premature death. Lysosomes are the principal cytosolic organelles affected in Fabry disease, and their normal function is necessary to several vital processes. They act in autophagy, endocytosis, exocytosis and phagocytosis among other functions. The regulation of lysosomal homeostasis is very important and recently it was demonstrated that the lysosomal-nucleus signaling participated of this process. The complete impact of the enzymatic deficiency in lysosomes with Fabry disease is still unknown. For this reason, the aim of our study is to evaluate Ca2+, mTOR and TFEB, the principal players of the machinery that regulates the autophagy and lysosomal biogenesis, in fibroblasts of Fabry disease patients. In this work, we characterized fibroblasts of Fabry disease patients, observing the deficiency of α-Gal A and the accumulation of Gb3. Also, it was verified an impaired lysosomal function in the enzymatic activity of β-Glucosidase, acid α-Glucosidase and α-L-Iduronidase. The biochemical parameters, that participated of the lysosomal homeostasis regulation and the cytoplasmic pH, were evaluated, but did not show significant differences, which suggests that the cells maintain the lysosomal regulation in equilibrium and cellular homeostasis, too. It was verified that the Ca2+cytoplasmatic (Ca2+cyt) e o Ca2+endoplasmic reticulum (Ca2+ret), in male and female patients cell cultures were modified, which, in turn, indicates alterations in mechanisms dependent on this ion. In conclusion, fibroblast of Fabry disease patients shows an alteration in the lysosomal enzymes evaluated, as well as, in the concentration of Ca2+cyt and Ca2+ret which seems do not to affect the lysosomal homeostasis regulation, or even the cellular equilibrium.

A doença de Fabry é uma das poucas doenças de depósito lisossômico que possui herança recessiva ligada ao cromossomo X. Uma mutação no gene GLA, gera uma deficiência da enzima alfa-Galactosidase A (α-Gal A), que junto com o acúmulo crescente de globotriaosilceramida (Gb3) resultam nos sinais e sintomas. Esta é uma doença crônica e as células do endotélio vascular são as mais comprometidas, levando a um comprometimento multiorgânico com algumas ocorrências neurológicas que podem causar uma morte prematura. Os lisossomos são as principais organelas citosólicas afetadas na doença de Fabry. O funcionamento normal destas organelas é necessário para vários processos vitais. Eles estão envolvidos na autofagia, endocitose, exocitose e fagocitose entre outras funções. A regulação da homeostase lisossômica é muito importante e, recentemente, se demonstrou que a sinalização lisossomo-núcleo participa desta regulação. Ainda não é totalmente conhecido o impacto da deficiência enzimática nos lisossomos de pacientes com doença de Fabry. Por esse motivo, o objetivo de nosso estudo foi avaliar as concentrações de Ca2+, mTOR e TFEB, os principais protagonistas da maquinaria que regula a autofagia e a biogênese lisossômica, em fibroblastos de pacientes com doença de Fabry. Neste trabalho caracterizamos fibroblastos de pacientes com doença de Fabry, observando a deficiência de α-Gal A e o acúmulo de Gb3. Além disso foi constatada uma disfunção lisossômica nas atividades enzimáticas de β-Glicosidase, α-Glicosidase ácida, α-L-Iduronidase. Os parâmetros bioquímicos, que participam da regulação da homeostase lisossômica e o pH citoplasmático foram avaliados, mas não mostraram diferenças significativas, o que sugere que as células mantêm a regulação lisossômica em equilíbrio e também a homeostase celular. Por outro lado, foi verificado que o Ca2+citoplasmático (Ca2+cit) e o Ca2+ do retículo endoplasmático (Ca2+ret), em culturas celulares de pacientes homens e mulheres, estão modificados. Isto sugere alterações em mecanismos dependentes deste íon. Concluindo, os fibroblastos de pacientes com doença de Fabry apresentam uma alteração das enzimas lisossômicas avaliadas, assim como do Ca2+cit e do Ca2+ret o que, por sua vez, não afetou a regulação dos parâmetros da homeostase lisossômica, como pode ser verificado mediante a análise de Ca2+lis, p-mTOR e TFEB, ou ainda, pelo equilíbrio celular avaliado por meio do pHcit.