Novas Estratégias Terapêuticas Para O Linfoma De Células Do Manto: Estudos Dos Efeitos Da Halofuginona
Data
2017-12-18
Autores
Santos, Melina Goncalves Dos 
Orientadores
Kerbauy, Daniella Marcia Bahia
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Introduction: mantle cell lymphoma (MCL) is characterized by the translocation t(11;14)(q13;q32), which takes to cyclin D1 overexpression, signaling pathways alterations and cell cycle activation. MCL responds to many initial therapies, but remissions are reached shortly and patients become chemoresistants over time. Treatment changes towards more intensive immunochemotherapies allow prolonged remissions, but the therapy intensification is a problem to elderly patients during clinical practice. Therefore, new drugs that reduce resistance and provide lasting responses are necessary. Halofuginone is an antifungal commonly used in poultry and it has recognized antifibrotic properties and mode of action associated with the TGF-β signaling pathway. Objectives: 1 - evaluate effects of halofuginone on MCL cell lines, through in vitro dose-response and time-dependent experiments designed to determine cytotoxic effects, cell cycle alterations and apoptosis; 2 - develop a xenograft model of MCL in mice; 3 - evaluate in vivo effects of halofuginone in subcutaneous tumors of MCL developed in mice. Materials and Methods: for in vitro experiments, cytotoxicity assays were performed with MTT and cell cycle and apoptosis studies evaluated by flow cytometry. For drug efficacy studies in animals, an in vivo model of MCL cell line was performed. Ninety mice were used, divided between experiments of intrafemoral or subcutaneous MCL cell line injection. In the mice submitted to intrafemoral injection, a xenograft model of MCL was established. In the animals submitted to subcutaneous injection, drug efficacy studies were performed with intraperitoneal injections of halofuginone. Animals were then separated into groups: control or treated, for each MCL cell line, and the effect of halofuginone was measured by the decrease of subcutaneous tumor volume. Results: cytotoxicity assays showed that halofuginone has significant cytotoxic effects on MCL cell lines, with IC50 values ranging from 72 nM, for Mino cell line (considered halofuginone sensitive), to 142 nM, for HBL-2 cell line (considered halofuginone resistant). In cell cycle and apoptosis studies, halofuginone induces apoptosis and cell cycle arrest at G1, with concentrations of 50 ng/mL for 24 hours for Mino cells and 200 ng/mL for 48 hours for HBL-2 cells. Cytometry assays showed engraftment for both MCL cell lines demonstrated by the presence of these cells in the mice spleen and bone marrow. For animals inoculated subcutaneously with HBL-2, on day 10 after injection, significant decrease on tumor volume (p<0,05) was observed in treated group compared to control. For the mice inoculated subcutaneously with Mino cells, there was significant difference (p<0,05) between the averages on tumor volumes, observed on days 16, 21, 23, 26 and 30 after subcutaneous injection, in the treated group compared to control. The time for mice sacrifice was 28 days for the control group and 30.2 days for the treated group (p<0,05). Conclusions: the effects of halofuginone were demonstrated on MCL cell line, with emphasis on the greater sensitivity of Mino cells as opposed to greater resistance of HBL-2 cells to the effects of halofuginone. These findings support a better exploration of the effect of halofuginone on MCL.
Introdução: o linfoma de células do manto (LCM) caracteriza-se pela t(11;14), que leva à hiperexpressão da ciclina D1, com alteração de vias de sinalização e ativação do ciclo celular. O LCM é responsivo a uma variedade de terapias iniciais, porém remissões são alcançadas em curto prazo e os pacientes tornam-se quimioresistentes ao longo do tempo. Mudanças no tratamento para regimes imunoquimioterápicos mais intensivos permitem remissões mais prolongadas, mas a intensificação da terapia na prática é um problema para pacientes com idade avançada. Por isso, novas drogas que combatam a resistência e proporcionem respostas duradouras são necessárias. A halofuginona é um antifúngico utilizado em aves, com reconhecida propriedade antifibrótica e ação associada com a via do TGF-β. Objetivos: 1 - avaliar os efeitos da halofuginona em linhagens de LCM, através de experimentos in vitro dose-resposta e séries temporais de determinação de efeitos citotóxicos, alterações no ciclo celular e apoptose; 2 - desenvolver um modelo de xenotransplante de linhagens de LCM em camundongos; 3 - avaliar os efeitos da halofuginona in vivo em tumores subcutâneos de LCM desenvolvidos em camundongos. Materiais e Métodos: para os experimentos in vitro, foram realizados estudos de citotoxicidade com MTT e estudos de ciclo celular e apoptose avaliados por citometria de fluxo. Para estudos de eficácia da droga em animais, desenvolveu-se um modelo in vivo de LCM com linhagens celulares. Foram utilizados 90 camundongos, alocados entre experimentos de injeção intrafemural ou subcutânea de linhagens de LCM. Nos camundongos submetidos à injeção intrafemural, foi estabelecido um modelo de xenotransplante de LCM. Nos camundongos que receberam injeção subcutânea, foram feitos estudos de eficácia da droga, através de injeções intraperitoneais de halofuginona. Os animais foram divididos em grupos: controle ou tratado, para cada linhagem, e o efeito da halofuginona foi mensurado através da diminuição do volume do tumor subcutâneo desenvolvido. Resultados: ensaios de citotoxicidade demonstraram que a halofuginona tem significativo efeito citotóxico em linhagens de LCM, com valores de IC50 que variaram de 72 nM, para a linhagem Mino (considerada sensível à ação da halofuginona), até 142 nM, para a linhagem HBL-2 (considerada resistente à ação da droga). Em estudos temporais de ciclo celular e apoptose, a halofuginona induziu apoptose e parada do ciclo celular xxiv em G1, em concentrações de 50 ng/mL após 24 horas, no caso das células Mino, e em concentrações de 200 ng/mL após 48 horas, no caso das células HBL-2. Ensaios de citometria demonstraram que, para ambas as linhagens, houve “pega” do xenotransplante, demonstrada pela presença dessas células em baço e medula óssea dos animais. Para os animais que receberam injeção subcutânea de HBL-2, no dia 10 após a injeção, foi observada diminuição significante (p<0,05) no tamanho do tumor no grupo tratado em relação ao controle. Já para os animais que receberam injeção subcutânea de Mino, houve diferença significante (p<0,05) entre as médias dos volumes dos tumores nos grupos tratado e controle, nos dias 16, 21, 23, 26 e 30 após a injeção. O tempo para eutanásia dos animais foi de 28 dias, para o controle, e 30,2 dias, para o tratado (p<0,05). Conclusões: foram demonstrados os efeitos da halofuginona em linhagens de LCM, com destaque para a maior sensibilidade das células Mino à ação da droga, em contraponto à maior resistência das células HBL-2 aos efeitos da halofuginona. Tais dados suportam uma melhor exploração do efeito da halofuginona em LCM.
Introdução: o linfoma de células do manto (LCM) caracteriza-se pela t(11;14), que leva à hiperexpressão da ciclina D1, com alteração de vias de sinalização e ativação do ciclo celular. O LCM é responsivo a uma variedade de terapias iniciais, porém remissões são alcançadas em curto prazo e os pacientes tornam-se quimioresistentes ao longo do tempo. Mudanças no tratamento para regimes imunoquimioterápicos mais intensivos permitem remissões mais prolongadas, mas a intensificação da terapia na prática é um problema para pacientes com idade avançada. Por isso, novas drogas que combatam a resistência e proporcionem respostas duradouras são necessárias. A halofuginona é um antifúngico utilizado em aves, com reconhecida propriedade antifibrótica e ação associada com a via do TGF-β. Objetivos: 1 - avaliar os efeitos da halofuginona em linhagens de LCM, através de experimentos in vitro dose-resposta e séries temporais de determinação de efeitos citotóxicos, alterações no ciclo celular e apoptose; 2 - desenvolver um modelo de xenotransplante de linhagens de LCM em camundongos; 3 - avaliar os efeitos da halofuginona in vivo em tumores subcutâneos de LCM desenvolvidos em camundongos. Materiais e Métodos: para os experimentos in vitro, foram realizados estudos de citotoxicidade com MTT e estudos de ciclo celular e apoptose avaliados por citometria de fluxo. Para estudos de eficácia da droga em animais, desenvolveu-se um modelo in vivo de LCM com linhagens celulares. Foram utilizados 90 camundongos, alocados entre experimentos de injeção intrafemural ou subcutânea de linhagens de LCM. Nos camundongos submetidos à injeção intrafemural, foi estabelecido um modelo de xenotransplante de LCM. Nos camundongos que receberam injeção subcutânea, foram feitos estudos de eficácia da droga, através de injeções intraperitoneais de halofuginona. Os animais foram divididos em grupos: controle ou tratado, para cada linhagem, e o efeito da halofuginona foi mensurado através da diminuição do volume do tumor subcutâneo desenvolvido. Resultados: ensaios de citotoxicidade demonstraram que a halofuginona tem significativo efeito citotóxico em linhagens de LCM, com valores de IC50 que variaram de 72 nM, para a linhagem Mino (considerada sensível à ação da halofuginona), até 142 nM, para a linhagem HBL-2 (considerada resistente à ação da droga). Em estudos temporais de ciclo celular e apoptose, a halofuginona induziu apoptose e parada do ciclo celular xxiv em G1, em concentrações de 50 ng/mL após 24 horas, no caso das células Mino, e em concentrações de 200 ng/mL após 48 horas, no caso das células HBL-2. Ensaios de citometria demonstraram que, para ambas as linhagens, houve “pega” do xenotransplante, demonstrada pela presença dessas células em baço e medula óssea dos animais. Para os animais que receberam injeção subcutânea de HBL-2, no dia 10 após a injeção, foi observada diminuição significante (p<0,05) no tamanho do tumor no grupo tratado em relação ao controle. Já para os animais que receberam injeção subcutânea de Mino, houve diferença significante (p<0,05) entre as médias dos volumes dos tumores nos grupos tratado e controle, nos dias 16, 21, 23, 26 e 30 após a injeção. O tempo para eutanásia dos animais foi de 28 dias, para o controle, e 30,2 dias, para o tratado (p<0,05). Conclusões: foram demonstrados os efeitos da halofuginona em linhagens de LCM, com destaque para a maior sensibilidade das células Mino à ação da droga, em contraponto à maior resistência das células HBL-2 aos efeitos da halofuginona. Tais dados suportam uma melhor exploração do efeito da halofuginona em LCM.