Endotélio venoso: estabelecimento e caracterização de culturas primárias e a produção de fatores derivados do endotélio de veia cava e veia porta de ratos

Abstract

The endothelial cell plays an essential role in vascular control by the release of Endothelium- Derived Relaxing Factors (EDRFs) [nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2) and endotheliumderived hyperpolarizing factor (EDHF)], and Endothelium-Derived Constrictor Factors (EDCFs) [prostaglandin H2 (PGH2) and Thromboxane A2 (TXA2), reactive oxygen species, Angiotensin II (Ang II) and Endothelin-1 (ET-1)]. Most of the studies related to EDRFs and EDCFs refers to arterial territories and little is known about distinct venous territories, such as vena cava (VC) and portal vein (PV). The present study investigated the physiology of the venous endothelial cell using primary cultures of VC and PV of rats. Venous segments were sectioned longitudinally, plated with the endothelial side facing down, covered with culture medium and kept in a 5% CO2 incubator at 37°C for 5 days. After removal of the explants, the cells were subcultured and cultures were studied between 4th and 5th passages. The characterization of the cultures was performed by immunocytochemistry for the specific markers von Willebrand Factor (vWF) and endothelial NO synthase (eNOS), and positive staining was also observed for ET-1 receptor (ETB) and Ang II receptors (AT1 and AT2). Basal NO production was observed in endothelial cultures pre-incubated with the DAF-2DA fluorescent probe and observed in confocal microscopy, and complemented by eNOS expression analysis determined by western blot (n = 4). Prostanoids production was quantified in the culture supernatants by enzyme-immunoassay technique (n = 5 to 6). Endothelial cultures of VC and PV showed similar values in the baseline rates of PGH2 (0.75 ± 0.04 ng/mL vs 0.76 ± 0.02 ng / mL, respectively); these levels were increased after stimulation with Ang II [1μM] (1.00 ± 0.07 * ng/mL for VC vs 1.13 ± 0.07 * ng/mL for PV). Baseline levels of PGI2 were different between cultures, with values of 29.12 ± 1.24 ng/mL for VC vs 35.10 ± 1.27 * ng/mL for PV. Ang II stimulation [1μM] increased PGI2 production in VC cells (36.50 ± 1.89 * ng/mL) but not in PV (37.70 ± 1.38 ng/mL) (* P <.05); however, COX expression (1 and 2) was similar between cultures (determined by western blot, n = 7). Stimulation with ET-1 [1μM] did not modify the release of prostanoids in both cultures. In summary, the venous endothelium can be isolated and studied through primary cultures; these cells, when studied in vitro, produce detectable amounts of NO and prostaglandins. The participation of PGI2 in the venodilation can be pronounced in PV when compared to VC. The consistent increase in PHG2 production by Ang II in VC and PV endothelium indicates the important endothelial modulation in the venoconstriction. The present data reveal new aspects of the vascular physiology, and may contribute to a better understanding of the venous responses to the blocking agents of the Renin Angiotensin System.

A célula endotelial exerce um papel essencial no controle vascular pela liberação de Fatores Relaxantes Derivados do Endotélio (EDRFs) [óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF)], e Fatores Constritores Derivados do Endotélio (EDCFs) [prostaglandina H2 (PGH2) e Tromboxano A2 (TXA2), espécies reativas de oxigênio, Angiotensina II (Ang II) e Endotelina-1 (ET-1)]. A maior parte dos estudos relacionados aos EDRFs e EDCFs refere-se a territórios arteriais e pouco se sabe sobre territórios venosos distintos, como veia cava (VC) e veia porta (VP). O presente estudo investigou a fisiologia da célula endotelial venosa utilizando culturas primárias de VC e VP de ratos. Segmentos venosos foram seccionados no sentido longitudinal, plaqueados com a face endotelial voltada para baixo, cobertos com meio de cultura e mantidos em incubadora de CO2 5% a 37ºC durante 5 dias. Após a remoção dos explantes, as células foram subcultivadas e as culturas foram estudadas entre a 4ª e 5ª passagens. A caracterização das culturas foi realizada por imunocitoquímica para os marcadores específicos Fator de Von Willebrand (vWF) e NO sintase endotelial (eNOS), observando-se também a marcação positiva de receptor de ET-1 (ETB) e receptores de Ang II (AT1 e AT2). A produção basal de NO foi observada em culturas endoteliais pré-incubadas com a sonda fluorescente DAF-2DA e observadas em microscopia confocal, e complementada pela análise de expressão de eNOS determinada por western blot (n=4). A produção de prostanoides foi quantificada no sobrenadante das culturas por técnica de enzimaimuno- ensaio (n= 5 a 6). Culturas endoteliais de VC e VP apresentaram valores semelhantes nas taxas basais de PGH2 (0,75±0,04 ng/mL vs 0,76±0,02 ng/mL, respectivamente); esses níveis foram aumentados após a estimulação com Ang II [1μM] (1,00±0,07* ng/mL para VC vs 1,13±0,07* ng/mL para VP). Os níveis basais de PGI2 foram diferentes entre as culturas estudadas, com valores de 29,12±1,24 ng/mL para VC vs 35,10±1,27* ng/mL para VP. A estimulação com Ang II [1μM] aumentou a produção da PGI2 em células de VC (36,50±1,89* ng/mL), mas não em VP (37,70±1,38 ng/mL) (*P<.05); entretanto, a expressão de COX (1 e 2) foi semelhante entre as culturas (determinada por western blot, n=7). A estimulação com ET-1 [1μM] não modificou a liberação dos prostanóides em ambas as culturas. Resumindo, o endotélio venoso pode ser isolado e estudado por meio de culturas primárias; essas células, quando estudadas in vitro, produzem quantidades detectáveis de NO e prostaglandinas. A participação de PGI2 na venodilatação pode ser pronunciada em VP quando comparada à VC. O aumento consistente na produção de PHG2 por Ang II em endotélio de VC e VP indica a importante modulação endotelial na venoconstrição. Os presentes dados revelam aspectos ainda não esclarecidos da fisiologia vascular, e podem contribuir para um melhor entendimento das respostas venosas aos agentes bloqueadores do Sistema Renina Angiotensina.