Células Tronco Embrionárias Murinas E Sua Diferenciação In Vitro Em Gametas Masculinos
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Data
2017-07-31
Autores
Serafim, Rui Cosme [UNIFESP]
Orientadores
Kerkis, Irina [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
To develop the protocol of differentiation of murine embryonic stem (ES) cells into the male gametes in vitro. To verify the occurrence of meiotic and postmeiotic germ cells. To select spermatid-like cells and test their functionality capacity by applying the ROSI (round spermatid injection) technique, injecting these cells into mature oocytes. To evaluate short- versus long-term effect of retinoic acid (RA) on functional capacity of these spermatid-like cells. Methods: To induce differentiation of ES cells (USPI) single-cell suspension was obtained, which was used to form cell aggregates called embryoid bodies (EB). EB were cultured in neurobasal medium, supplemented with B27 and retinoic acid (RA). RA was applied to culture medium with EB once (Gl) or multiple times every 48 hours during the differentiation period (G2). The differentiation process was evaluated following microscopic observation and analysis of expression of stagespecific molecular markers by means of RT-PCR. Additionally, immunofluorescence assay was carried out. When spermatid-like cells were obtained, ROSI was performed in mature oocytes derived from pseudo-pregnant mice. Results: Right at the start of differentiation germinal epithelium-like cells were formed. The occurrence of meiosis was confirmed by analysis of the expression of proteins Sycpl and Sycp3, which are components of the synaptonemic complex, and other proteins, for example mvh (mouse VASA homolog) that is located in the chromatoid body. Throughout the differentiation, the cells morphologically similar to the round spermatids were formed and used in ROSI. Of the 357 fertilized oocytes, 207 (57.98%) were cultured until morula stage. Significant statistical differences in fertilization capacity were observed between groups Gl and G2. Conclusions: We demonstrated that the established method have the capacity to produce the spermatid-like cells directly from ES cells without any pre-selection or gene modification, which were able to fertilize the mature oocytes. We also demonstrated that the potential for fertilization of mature eggs by ROSI is related to these cells exposure to RA during the period of differentiation. The results evidenced the benefit of long treatment with RA and the existence of functional quality peaks in differentiated cells every two days (G2).
Desenvolvimento de protocolo da diferenciação de células tronco embrionárias (CTE) murinas em gametas masculinos in vitro. Verificar a ocorrência de células germinativas meióticas e pós-meióticas. Selecionar células espermátidessímile e testar a sua funcionalidade (capacidade de fertilizar um ovócito), aplicando a técnica ROSI (do inglês: ROSI - round spermatid injection) injetando estas células em ovócitos maduros. Avaliar o efeito do uso breve versus prolongado do ácido retinóico (AR) na capacidade funcional das células espermátides-símile. Métodos: A diferenciação das CTE (USP 1) foi induzida através de obtenção das suspensão celular e formação dos agregados celulares chamadas corpos embrióides (CE). CE foram cultivados em meio neurobasal, suplementado com B27 e AR. AR foi aplicado nos CE uma única vez (Gl) ou múltiplas vezes a cada 48 horas durante o período de diferenciação (G2). O processo de diferenciação foi avaliado por meio da observação microscópica e analise da expressão de marcadores moleculares estágio-específico por meio de RT-PCR. Ensaio de imunofluorescência também foi realizado. Quando obtidas as células espermátidessímile, procedeu-se ROSI em ovócitos maduros de camundongos pseudo-grávidas. Resultados: Logo no início de diferenciação observou-se a formação de células semelhantes ao epitélio germinativo. A ocorrência de meiose foi confirmada através pela analise da expressão de proteínas Sycpl e Sycp3, componentes do complexo sinaptonêmico e outras proteínas como mvh (mouse VASA homolog) que se localiza no corpo cromatóide. Ao longo da diferenciação células morfologicamente semelhantes ás espermátides redondas são formadas e utilizadas em ROSI. Dos 357 ovócitos fertilizados, 207 (57,98%) foram cultivados até estagio de mórula. Diferenças estatísticas significantes na capacidade de fertilização foram observadas entre os grupos Gl e G2. Conclusões: Demonstramos que o método estabelecido tem a capacidade de produzir células espermátides-símile diretamente das CET sem nenhuma préseleção ou modificação gênica, estas foram capazes de fertilizar os ovócitos maduros. Demonstramos ainda, que o potencial de fertilização de ovócito de segunda ordem, por ROSI, está relacionado à exposição destas células ao AR durante o período de diferenciação. Os resultados evidenciam a existência de picos de qualidade funcional de células diferenciadas in vitro a cada dois dias.
Desenvolvimento de protocolo da diferenciação de células tronco embrionárias (CTE) murinas em gametas masculinos in vitro. Verificar a ocorrência de células germinativas meióticas e pós-meióticas. Selecionar células espermátidessímile e testar a sua funcionalidade (capacidade de fertilizar um ovócito), aplicando a técnica ROSI (do inglês: ROSI - round spermatid injection) injetando estas células em ovócitos maduros. Avaliar o efeito do uso breve versus prolongado do ácido retinóico (AR) na capacidade funcional das células espermátides-símile. Métodos: A diferenciação das CTE (USP 1) foi induzida através de obtenção das suspensão celular e formação dos agregados celulares chamadas corpos embrióides (CE). CE foram cultivados em meio neurobasal, suplementado com B27 e AR. AR foi aplicado nos CE uma única vez (Gl) ou múltiplas vezes a cada 48 horas durante o período de diferenciação (G2). O processo de diferenciação foi avaliado por meio da observação microscópica e analise da expressão de marcadores moleculares estágio-específico por meio de RT-PCR. Ensaio de imunofluorescência também foi realizado. Quando obtidas as células espermátidessímile, procedeu-se ROSI em ovócitos maduros de camundongos pseudo-grávidas. Resultados: Logo no início de diferenciação observou-se a formação de células semelhantes ao epitélio germinativo. A ocorrência de meiose foi confirmada através pela analise da expressão de proteínas Sycpl e Sycp3, componentes do complexo sinaptonêmico e outras proteínas como mvh (mouse VASA homolog) que se localiza no corpo cromatóide. Ao longo da diferenciação células morfologicamente semelhantes ás espermátides redondas são formadas e utilizadas em ROSI. Dos 357 ovócitos fertilizados, 207 (57,98%) foram cultivados até estagio de mórula. Diferenças estatísticas significantes na capacidade de fertilização foram observadas entre os grupos Gl e G2. Conclusões: Demonstramos que o método estabelecido tem a capacidade de produzir células espermátides-símile diretamente das CET sem nenhuma préseleção ou modificação gênica, estas foram capazes de fertilizar os ovócitos maduros. Demonstramos ainda, que o potencial de fertilização de ovócito de segunda ordem, por ROSI, está relacionado à exposição destas células ao AR durante o período de diferenciação. Os resultados evidenciam a existência de picos de qualidade funcional de células diferenciadas in vitro a cada dois dias.