Análise Da Expressão Da Proteína Limd2 Em Amostras De Carcinoma Papilífero Da Tiroide Metastático E Nãometastático: Correlação Com O Perfil Da Mutação V600E No Gene Braf

Abstract

Thyroid neoplasms are the most frequent neoplasms of endocrine system, being papillary thyroid carcinoma (PTC) are the most common, accounting for about 80% of all cases. Although it usually has an excellent prognosis, 30-65% of PTC cases already show metastasis at diagnosis. Alterations in genes encoding proteins from MAPK pathway, such as mutation in the BRAF gene or RET/PTC fusions, occur in about 75% of the cases of PTC. The presence of the BRAF V600E mutation is the most prevalent genetic event and has been associated with more aggressive clinical features such as the presence of metastatic lymph nodes and distant metastasis, as well as an increased risk of tumor recurrence. In an attempt to better understand the metastatic process of PTC, our group, using the methodology of SAGE (Serial Analysis of Gene Expression), has identified LIMD2 as a gene associated with the metastatic process. LIMD2 encodes a protein containing a LIM domain, and is part of a group of proteins known to be associated with important biological processes associated with metastasis, such as cytoskeletal organization, cell adhesion and motility, besides the gene transcription regulation. We investigated the expression of LIMD2 protein in a series of PTCs and lymph node metastases, and correlated with prognostic variables associated with aggressiveness and high risk of recurrence. The expression of LIMD2 was investigated in 81 cases of PTC (40 metastatic and 41 non-metastatic) and 28 paired metastases by immunohistochemistry. LIMD2 was expressed in 78% of PTC and 93% of metastases. Interestingly, most paired metastases showed a higher LIMD2 expression than primary tumors. Since the metastatic process is strongly associated with the BRAF V600E mutation in the PTC, we investigated the presence of 17 mutations in exon 15 of the BRAF gene in these samples. LIMD2 was strongly associated with the BRAF V600E mutation. However, we did not observe any association with clinico-pathological characteristics. We also analyzed the expression of LIMD2 in two PTC-derived cell lines (BCPAP and TPC-1), two follicular carcinoma-derived cell lines (FTC-133 and FTC- 238), and a normal thyroid follicular cell line (Nthy-ori 3-1). Interestingly, LIMD2 was highly expressed in BCPAP and poorly expressed in TPC-1, and was not expressed in either follicular carcinoma or normal lines. This result supports the association of LIMD2 and BRAF, since only the BCPAP line harbors the BRAF V600E mutation. In addition, our data suggest that the MAPK pathway can activate LIMD2, since TPC-1 harbors the RET/PTC1 fusion. With the recent publication of the analysis of nearly 500 PTC samples by the Cancer Genome Atlas Research Network (TCGA), a "gene signature" was associated with PTCs with BRAF V600E mutation and RET/PTC fusion, with a preferential activation of MAPK pathway, and also a signature associated with PTCs with mutations in the RAS family genes and PAX8-PPARG rearrangements, with a preferential activation of PI3K/AKT pathway. These two signatures were named BRAF-like and RAS-like, respectively. By analyzing the available data from the TCGA, we found that the expression of LIMD2 is greater in BRAF-like PTCs when compared to RAS-like PTCs. Although our data, together with the analysis of the TCGA data, suggest that the abnormal activation of the MAPK pathway increases the expression of LIMD2, further analysis needs to be done to clarify this issue. However, our data suggest that LIMD2 plays an important role in the metastatic process of PTC, especially in BRAFV600E-positive tumors.

As neoplasias da tiroide são as mais frequentes do sistema endócrino, sendo o carcinoma papilífero da tiroide (CPT) o mais frequente, que corresponde a cerca de 80% de todos os casos. Embora normalmente apresente um excelente prognóstico, 30-65% dos casos de CPT já apresentam metástase ao diagnóstico. Alterações nos genes que codificam proteínas que participam da via MAPK (Mitogen-activated protein kinase), tais como mutação no gene BRAF (B-Raf protooncogene, serine/threonine kinase) ou fusões RET/PTC, ocorrem em aproximadamente 75% dos casos de CPT. A presença da mutação V600E do gene BRAF é o evento genético mais prevalente e tem sido associada com características clínicas mais agressivas como a presença de linfonodos metastáticos e metástase à distância, além de um maior risco de recorrência do tumor. Na tentativa de melhor compreender o processo metastático do CPT, nosso grupo, através da técnica de SAGE (do inglês, Serial Analysis of Gene Expression) identificou uma série de genes associados ao processo metastático, entre estes LIMD2. LIMD2 codifica uma proteína contendo domínio LIM, e faz parte de um grupo de proteínas sabidamente associadas com processos biológicos importantes no processo de metástase, como organização do citoesqueleto, adesão e motilidade celular, além de regular a transcrição gênica. Desta forma, neste trabalho investigamos a expressão da proteína LIMD2 em uma série de CPTs e metástases para linfonodos, e correlacionamos com variáveis prognósticas associadas com maior agressividade e risco de recorrência. A expressão de LIMD2 foi investigada em 81 casos de CPT (40 metastáticos e 41 nãometastáticos) e 28 metástases pareadas através da técnica de imunohistoquímica. 14 LIMD2 foi expresso em 78% dos CPT e 93% das metástases. Interessante, a maior parte das metástases pareadas apresentaram uma expressão de LIMD2 maior do que os tumores primários. Já que o processo metastático é fortemente associado com a mutação BRAF V600E no CPT, nós investigamos a presença de mutações no exon 15 do gene BRAF nestas amostras. A expressão de LIMD2 foi fortemente associada com a mutação BRAF V600E. Contudo, não observamos nenhuma associação com características clinico-patológicas. Ainda, analisamos a expressão de LIMD2 em duas linhagens celulares derivadas de CPT (BCPAP e TPC-1), duas linhagens derivadas de carcinoma folicular (FTC-133 e FTC-238), e uma linhagem derivada de célula folicular da tiroide normal (Nthy-ori 3-1). Interessante, LIMD2 foi altamente expressa em BCPAP e fracamente expressa em TPC-1, e não foi expressa nem nas linhagens de carcinoma folicular, nem na linhagem normal. Este resultado reforça a associação de LIMD2 e BRAF, uma vez que somente a linhagem BCPAP apresenta a mutação BRAF V600E. Além disso, nossos dados sugerem que LIMD2 pode ser ativado pela via MAPK, visto que TPC-1 apresenta a fusão RET/PTC1. Com a recente publicação da análise de quase 500 amostras de CPT realizada pelo The Cancer Genome Atlas Research Network (TCGA), identificou-se uma “assinatura gênica” associada aos CPTs com mutação em BRAF V600E e RET/PTC, com uma consequente ativação preferencial da via MAPK, e uma assinatura associada à CPTs com mutação nos genes da família RAS e rearranjos PAX8-PPARG, com uma consequente ativação preferencial da via PI3K/AKT. Essas duas assinaturas foram denominadas BRAF-like e RAS-like, respectivamente. Através da análise dos dados disponíveis do TCGA, verificamos que a expressão de LIMD2 é maior em CPTs BRAF-like quando comparados com CPTs RAS-like. 15 Embora nossos dados, juntamente com a análise dos dados do TCGA, sugiram que a ativação anormal da via MAPK aumenta a expressão de LIMD2, análises adicionais precisam ser feitas para esclarecer essa questão. Contudo, nossos dados sugerem que LIMD2 tem um papel importante no processo metastático do CPT, principalmente em tumores BRAF V600E-positivos.