Analise comparativa da atividade dos inibidores de tirosina kinase por meio da modulação da via gsk-3 beta

Analise comparativa da atividade dos inibidores de tirosina kinase por meio da modulação da via gsk-3 beta

Author Silva, Janaina Peixoto da Autor UNIFESP Google Scholar
Advisor Trindade, Claudia Bincoletto Trindade Autor UNIFESP Google Scholar
Institution Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Graduate program Farmacologia
Abstract Chronic Myeloid Leukemia is a myeloproliferative hematologic malignancy characterized by a specific chromosomal abnormality, the BCR-ABL, which is constitutively active, responsible for several signaling pathways activation, such as Ras, NF-kβ, STAT5 and PI3- K / Akt. The BCR-ABL protein identification allowed the establishment of a new therapy with the inhibitors of tyrosine kinase (ITKs) of the first (Imatinib Mesylate - MI) and second generation (Nilotinib - NTB). However, prolonged treatment leads patient resistance, decreasing the therapeutic effectiveness, therefore, it’s important to introduce other drugs to the treatment. Recent studies showed that inhibitors of glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) induce apoptosis and inhibit proliferation of leukemic cells without interfering in the normal hematopoietic stem cells proliferation, suggesting that this pathway could be a new therapeutic target for the treatment of leukemias. Therefore, we evaluate whether inhibitors of GSK-3β would increase the activity of ITKs. Then, we defined the concentrations of ITKs, MI (10 µm) and NTB (5μM) by cytotoxicity study in the K-562 cells, using the assay for cell viability by staining with trypan blue. The concentration of the GSK-3β inhibitor LIT, was defined after the cell cycle analysis by flow cytometry by staining with propidium iodide (PI). Although the ITKs has not increased the phase SubG1significantly, they inhibit the cell cycle in G2/M. Thus, we defined the concentration of LIT (20 mM), to be used in this study. Thereafter, we studied the associations of the NTB+LIT e MI+LIT using trypan blue exclusion assay, flow cytometry with PI and flow cytometry with Annexin-V labeling by FITC in order to examine the cytotoxicity, the cycle cell and the cell death stages, respectively. The association of NTB+LIT leads to K-562 cells death significantly, however, the combination of the LIT+MI did not show the same response pattern, blocking only G2/M phase. Curiously, when analyzing the activation of caspase-3, we found that the associations of the LIT to ITKs partially activated caspase-3 when compared to LIT, suggesting that the association could start caspase-independent cell death. Thus, to assess whether the inhibition of cell proliferation is related to the modulation of the GSK-3β, we analyzed the GSK-3β protein, total and phosphorylated. We found that the associations of LIT with both (NTB and IM) inhibited cell proliferation through the phosphorylation of GSK-3β pathway. It is noteworthy that both associations reduced the BCR-ABL protein. Interesting that in the clonogenic assay, the LIT drastically reduced the number of colonies either alone or in association with MI. Although NTB completely reduced the number of colonies, the LIT maintained the same pattern of response of the NTB. Based on these data, we suggest that GSK-3β inhibition by LIT potentiates the antiproliferative and cytotoxic effects of the NTB and MI, respectively. Studies are underway to elucidate more precisely the cellular mechanisms involved in the increased activity of ITKs by inhibitors of GSK-3β and the inter-relationship with apoptosis and caspase-independent cell death.

A Leucemia Mielóide Crônica é uma neoplasia hematológica mieloproliferativa, caracterizada por uma anormalidade cromossômica específica, a BCR-ABL, que se encontra constitutivamente ativa, sendo responsável pela ativação de diversas vias de sinalização, tais como: Ras, NF-kβ, STAT5 e PI3-K/Akt. A identificação da proteína BCR-ABL permitiu o estabelecimento de uma nova terapia com inibidores de tirosina quinase (ITK) de primeira (Mesilato de Imatinibe - MI) e segunda geração (Nilotinibe - NTB). Entretanto, o tratamento prolongado pode conduzir o paciente à resistência, diminuindo a efetividade terapêutica sendo, portanto, importante a associação com outros fármacos. Estudos recentes demonstraram que os inibidores de glicogênio síntase kinase 3 (GSK-3) induzem apoptose e inibem a proliferação de células leucêmicas, sem interferir na proliferação de células-tronco hematopoiéticas normais, sugerindo um novo alvo terapêutico para o tratamento das leucemias. Diante do exposto, avaliamos se os inibidores de GSK-3β seriam capazes de aumentar a atividade dos ITKs. Para isso, foram definidas primeiramente as concentrações dos ITKs, MI (10μM) e NTB (5μM), pelo estudo da citotoxicidade em células K-562, utilizando o ensaio de viabilidade celular por marcação com azul de tripano. A concentração do inibidor de GSK-3β LIT, foi definida após a análise do ciclo celular por meio da citometria de fluxo por marcação com iodeto de propídeo (PI). Embora o LIT não tenha aumentado à fase SubG1 de forma significativa, o mesmo foi capaz de inibir o ciclo celular na fase G2/M. Desta forma, foi definida a concentração do inibidor de GSK-3β, LIT (20mM), a ser utilizada nesse estudo. Diante disso, foram estudadas as associações de NTB+LIT e MI+LIT pelo ensaio de viabilidade celular por marcação com azul de tripano, citometria de fluxo com marcação para PI e citometria de fluxo com marcação para Anexina-V FITC, a fim de analisar a citotoxicidade, o ciclo celular e os estágios de morte celular, respectivamente. A associação de NTB ao LIT conduziu as células k-562 à morte celular de forma significativa, entretanto, a associação de MI ao LIT não apresentou o mesmo padrão de resposta, bloqueando apenas a fase G2/M. Interessante que ao analisar os ensaios de ativação de caspase-3, verificamos que as associações de LIT aos ITKs ativaram parcialmente caspase-3 quando comparado ao LIT, sugerindo que a associação também poderia iniciar a morte celular caspase-independente. Para avaliar se a inibição da proliferação celular estaria relacionada com a modulação da via GSK-3β, foram analisadas as proteínas GSK-3β fosforilada e total. Diante dos resultados, observamos que as associações de LIT aos ITKs inibiram a proliferação celular por intermédio da fosforilação e inibição da via GSK-3β. Vale ressaltar que ambas as associações reduziram a concentração da proteína BCR-ABL. Um fato importante foi a drástica redução no número de colônias pelo tratamento com LIT e sua associação ao MI em ensaios clonogênicos. Embora NTB tenha reduzido completamente o número de colônias, o LIT manteve o mesmo padrão de resposta do NTB, após a associação. Os dados apresentados neste trabalho sugerem que a inibição da via da GSK-3 pelo LIT, potencializa os efeitos citotóxicos e antiproliferativos do NTB e MI, respectivamente. Estudos estão em andamento para elucidar mais precisamente os mecanismos celulares envolvidos no aumento da atividade dos ITKs pelos inibidores de GSK-3β e sua inter-relação com a apoptose e morte celular caspase-independente.
Keywords tirosina kinase
modulação da via gsk-3 beta
morte celular
leucemia mielóide
Language Portuguese
Date 2013-10-30
Published in SILVA, Janaina Peixoto da. Analise comparativa da atividade dos inibidores de tirosina kinase por meio da modulação da via gsk-3 beta. 2013. 85 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2013.
Research area Farmacologia
Knowledge area Ciências biológicas
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 85 p.
Origin https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=90328
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/48968

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