Caracterização do perfil funcional e fenotípico de monócitos em pacientes sépticos
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Data
2015-12-31
Autores
Sousa, Sidneia da Silva [UNIFESP]
Orientadores
Salomão, Reinaldo [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
Introdução: O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra infecções. A erradicação de microorganismos por monócitos, depende em grande parte da capacidade fagocítica e posterior geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), assim como produção de óxido nítrico (NO) e citocinas. Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica (SIRS) provocada por uma infecção e a natureza da resposta inflamatória ressaltando a fisiopatologia da sepse tem sido extensivamente estudada. Compreender a natureza de como a resposta inflamatória ressalta a fisiopatologia da sepse não só ajuda a esclarecer os mecanismos da síndrome, mas também leva à identificação de novos alvos terapêuticos. Objetivo: Avaliar se funções de monócitos seriam reguladas diferencialmente em um paciente com septicemia através da avaliação simultânea da atividade fagocitária, geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), óxido nítrico e a produção de citocinas inflamatórias (IL-6 e TNF-α). Materiais e métodos: Foi coletado sangue em heparina de 34 pacientes sépticos nos dias zero (D0), até 48h após o evento sepse. Foi realizada uma segunda coleta em 15 destes pacientes sete dias (D7) depois da primeira. A produção de EROs, NO e Citocinas foi mensurada por citometria de fluxo. Para EROs e NO utilizou-se os regentes DCFH-DA, DAF-FMDA, respectivamente, incubados por 30 minutos em banho maria 37°C. Para citocinas utilizamos o reagente Brefeldina A incubado na estufa de CO2 a 37°C por 4 h. IL-6 e TNF-α intracelular foram detectados utilizando anticorpos específicos conjugados com fluorocromos. Nos ensaios foi observada a produção espontânea e após os estímulos com LPS, P. aeruginosa e S. aureus. Funções de monócitos também foram avaliadas em subgrupos de monócitos CD163+ e CD163-. Para o ensaio de fagocitose foi utilizado bactérias E. coli conjugadas com fluorescência. Os dados foram adquiridos no programa FACSDiva e analisados no programa FlowJo. Resultados: Monócitos de pacientes sépticos apresentaram preservada fagocitose, aumento da produção de EROs e NO e diminuição da produção de citocinas inflamatórias, em comparação com os monócitos dos voluntários sadios. Aumento TNF-α e IL-6 e diminuição da geração de EROs e NO foi observada nas amostras do D7 em comparação com amostras D0. Em geral, monócitos CD163+ produziram quantidades elevadas de IL-6 e TNF-α e menores quantidades de EROs e NO do que os monócitos CD163-. Conclusão: Em conclusão, demonstramos que monócitos de pacientes sépticos, que são incapazes de produzir citocinas inflamatórias, exibem potente atividade fagocítica e aumento da geração de ROS e NO. O aumento da produção de EROs e NO e diminuição de citocinas (IL-6 e
TNF-α) no início da sepse reforçam a existência de uma reprogramação celular com consequente diminuição da inflamação ao mesmo tempo em que aumenta a produção de moléculas microbicidas, como NO e EROs para manter a capacidade das células de eliminação de patógenos promovendo assim uma homeostase do organismo.
Background The nature of the inflammatory response underscoring the pathophysiology of sepsis has been extensively studied. We hypothesized that different cell functions would be differentially regulated in a patient with sepsis. Thus, we evaluated modulation of monocyte functions during sepsis by simultaneously assessing their phagocytic activity, the generation of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) and the production of inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α). Methods Whole blood was obtained from septic patients (SP) both at admission (D0, n=34) and after seven days of therapy (D7, n=15); 19 healthy volunteers (HV) were included as a control group. The cells were stimulated with LPS, P. aeruginosa, and S. aureus. The ROS and NO levels were quantified in monocytes in whole blood by measuring the oxidation of 2,7-dichlorofluorescein diacetate and 4-amino-5-methylamino-2,7- difluorofluorescein diacetate, respectively. Intracellular IL-6 and TNF-α were detected using fluorochrome-conjugated specific antibodies. Monocyte functions were also evaluated in CD163+ and CD163- monocyte subsets. Findings The monocytes from SP presented with preserved phagocytosis, enhanced ROS and NO generation, and decreased production of inflammatory cytokines compared with the monocytes from HV. TNF-α and IL-6 increased and ROS generation decreased in D7 compared with D0 samples. In general, CD163+ monocytes produced higher amounts of IL-6 and TNF-α and lower amounts of ROS and NO than did CD163- monocytes. Interpretation In conclusion, we demonstrated that monocytes from septic patients, which are unable to produce inflammatory cytokines, display potent phagocytic activity and increased ROS and NO generation.
Background The nature of the inflammatory response underscoring the pathophysiology of sepsis has been extensively studied. We hypothesized that different cell functions would be differentially regulated in a patient with sepsis. Thus, we evaluated modulation of monocyte functions during sepsis by simultaneously assessing their phagocytic activity, the generation of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) and the production of inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α). Methods Whole blood was obtained from septic patients (SP) both at admission (D0, n=34) and after seven days of therapy (D7, n=15); 19 healthy volunteers (HV) were included as a control group. The cells were stimulated with LPS, P. aeruginosa, and S. aureus. The ROS and NO levels were quantified in monocytes in whole blood by measuring the oxidation of 2,7-dichlorofluorescein diacetate and 4-amino-5-methylamino-2,7- difluorofluorescein diacetate, respectively. Intracellular IL-6 and TNF-α were detected using fluorochrome-conjugated specific antibodies. Monocyte functions were also evaluated in CD163+ and CD163- monocyte subsets. Findings The monocytes from SP presented with preserved phagocytosis, enhanced ROS and NO generation, and decreased production of inflammatory cytokines compared with the monocytes from HV. TNF-α and IL-6 increased and ROS generation decreased in D7 compared with D0 samples. In general, CD163+ monocytes produced higher amounts of IL-6 and TNF-α and lower amounts of ROS and NO than did CD163- monocytes. Interpretation In conclusion, we demonstrated that monocytes from septic patients, which are unable to produce inflammatory cytokines, display potent phagocytic activity and increased ROS and NO generation.
Descrição
Citação
SOUSA, Sidneia da Silva. Caracterização do perfil funcional e fenotípico de monócitos em pacientes sépticos. 2015. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.