O papel da espécies reativas de oxigênio e do antioxidante astaxantina em oócitos bovinos submetidos ao estresse térmico in vitro

Abstract

Condições ambientais adversas, tais como temperatura e umidade elevada, limitam a exploração do máximo potencial genético animal. Em bovinos, o estresse térmico materno compromete a fertilidade de vacas leiteiras, resultando em prejuízos econômicos para indústria de leite. Sabe-se que o oócito e o embrião no estágio pré-implantacional inicial são os principais alvos dos efeitos deletérios causados pelo estresse térmico materno, entretanto, os mecanismos celulares desencadeados pela temperatura elevada e o papel do estresse oxidativo neste contexto são pouco conhecidos. Estudos recentes indicaram que a exposição de embriões bovinos ao choque térmico aumentou a concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular embrionária e o uso de antioxidantes, tais como a astaxantina, reverteram estes efeitos. Com isto, o presente estudo visou avaliar os efeitos do choque térmico e do antioxidante astaxantina durante a maturação in vitro (MIV) de oocitos bovinos na (1) concentração das EROs, (2) competência oocitária, (3) atividade de enzimas antioxidantes e (4) peroxidação lipídica em complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos. O experimento 1 avaliou os efeitos de diferentes concentrações de astaxantina (0, 50, 100, 200 ou 500 µM) na competência oocitária à 38,5°C (etapa 1) e os efeitos de diferentes concentrações de astaxantina (0, 12,5, 25, 50, 100 ou 50 000 nM) na competência de oocitos bovinos submetidos ao choque térmico (etapa 2). As doses de 100, 200 e 500 µM de astaxantina reduziram (P< 0,05) a proporção de embriões clivados que atingiu o estágio de blastocisto. A exposição de oocitos bovinos ao choque térmico reduziu (P< 0,05) as taxas de clivagem e blastocistos. No entanto, a adição de astaxantina em oocitos submetidos ao modelo de choque térmico resgatou a clivagem embrionária (P<0,05); doses de 12,5, 25, 50, 100 e 50 000 nM de astaxantina) e o desenvolvimento a blastocisto (P< 0,05; doses de 12,5 e 25 nM de astaxantina) quando comparadas ao grupo controle-veículo 41°C. O experimento 2 visou padronizar a técnica de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) em CCOs bovinos. Para tanto, foram realizados vários estudos preliminares a fim de estabelecer o protocolo de RPE em CCOs. No entanto, não foi possível detectar as EROs em CCOs na maioria dos procedimentos conduzidos. Quando CCOs submetidos aos tratamentos Controle (38,5°C por 14 horas) e Choque Térmico (41°C por 14 horas) foram incubados com 100 µM do pró-oxidante menadiona e 50 mM de PBN em meio MIV e PBS 10 mM 1:1 as EROs foram detectadas apenas no grupo choque térmico. Os experimentos 3 e 4 avaliaram os efeitos da astaxantina (0, 12,5 e 25 nM) e da temperatura (38,5 ou 41°C) durante as primeiras 14 horas da MIV na atividades das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase - SOD, glutationa peroxidase - GPX e catalase - CAT) e os níveis de peroxidação lipídica no meio MIV. O choque térmico não afetou a atividade das enzimas GPX, SOD e CAT em oócitos ou células do cumulus e a taxa de peroxidação lipídica no meio MIV. Em oocitos submetidos ao choque térmico as doses de 12,5 (P=0,09) e 25 nM (P<0,05) astaxantina estimularam a atividade de GPX quando comparado aos oócitos do grupo controle veiculo 41°C. Em contraste, a dose de 25 nM de astaxantina reduziu (P<0,05) a atividade de GPX em células do cumulus independente de temperatura. A atividade da enzima SOD foi estimulada (P<0,05) em oocitos do grupo controle maturados com 25 nM de astaxantina em relação a 0 nM de astaxantina. A dose de 12,5 nM de astaxantina estimulou (P<0,05) a atividade de SOD em oocitos do grupo choque térmico em relação a mesma dose no grupo controle. O perfil de atividade da SOD em células do cumulus variou com a dose. Enquanto a dose de 12,5 nM de astaxantina inibiu a SOD,a dose de 25 nM estimulou a atividade de SOD no grupo choque térmico. Houve tendência (P=0,09) da dose de 12,5 nM de astaxantina em aumentar a atividade de CAT em oócitos apenas durante o choque térmico. Foi também observada uma tendência da dose de 12,5 nM de astaxantina em aumentar (P= 0,09) a formação do MDA/TBA no grupo estressado termicamente, quando comparado a mesma dose durante a temperatura controle. Em conclusão, o choque térmico afetou a competência oocitária e a astaxantina reverteu esse efeito resgatando a competência oocitária. É possível que este efeito da astaxantina tenha sido mediado pelo aumento na atividade de enzimas GPX, SOD e CAT em oócitos submetidos ao choque térmico. As vias pelas quais este antioxidante exerce efeito termoprotetor ainda não foram completamente compreendidas.

Adverse environmental conditions such as temperature and high humidity, limiting the exploitation of animal genetic maximum potential. In cattle, maternal heat stress compromises the fertility of dairy cows, resulting in economic losses to the dairy industry. It is known that the oocyte and embryo in early preimplantation stage are the main targets of the deleterious effects caused by maternal heat stress, however, the cellular mechanisms triggered by elevated temperature and the role of oxidative stress in this context are poorly understood. Recent studies have indicated that exposure of bovine embryos to heat shock increased the concentration of reactive oxygen species (ROS) and the use of embryonic intracellular antioxidants, such as astaxanthin, reversed these effects. With this, the present study aimed to evaluate the effects of heat shock and antioxidant astaxanthin during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes in (1) concentration of ROS, (2) oocyte competence, (3) the activity of antioxidant enzymes and (4) lipid peroxidation in cumulus - oocyte complexes (COCs) cattle. The first experiment evaluated the effects of different concentrations of astaxanthin (0, 50, 100, 200 or 500 mM) in oocyte competence to 38.5°C (step 1) and the effects of different concentrations of astaxanthin (0, 12.5, 25, 50, 100 or 50 000 nM) in the competence of bovine oocytes subjected to heat shock (step 2) . Doses of 100, 200 and 500 mM of astaxanthin decreased (P < 0.05) than the proportion of cleaved has reached the blastocyst stage embryos. Exposure of bovine oocytes to heat shock reduced (P < 0.05) rates of cleavage and blastocyst. However, the addition of astaxanthin in oocytes subjected to heat shock model rescued the embryonic cleavage (P < 0.05; doses of 12.5, 25, 50, 100, and 50 000 nM astaxanthin) and development to blastocyst ( P < 0.05; doses of 12.5 and 25 nM of astaxanthin) compared to the vehicle control group 41°C. Experiment 2 aimed to standardize the technique of electron paramagnetic resonance (EPR ) in bovine oocytes. To this end, several preliminary studies were conducted to establish the protocol RPE in COCs. However, it was not possible to detect ROS in oocytes conducted in most procedures. When subjected to the control oocytes (38.5°C for 14 hours) and hot water (41°C for 14 hours) treatments were incubated with 100 mM of pro-oxidant menadione and 50 mM PBN in IVM medium and 10 mM PBS 1:1 ROS were detected only in group thermal shock. The experiments 3 and 4 assessed the effects of astaxanthin (0, 12.5 and 25 nM) and temperature (38.5 or 41°C) during the first 14 hours of the IVM in the activities of antioxidant enzymes (superoxide dismutase – SOD, glutathione peroxidase - GPX and catalase - CAT) and lipid peroxidation levels in IVM medium. Heat shock did not affect the activity of GPX, SOD and CAT enzymes in oocytes and cumulus cells and the rate of lipid peroxidation in the IVM medium. In oocytes subjected to thermal shock doses of 12.5 (P = 0.09 ) and 25 nM (P <0.05) astaxanthin stimulated GPX activity when compared to the vehicle control group oocytes 41°C. In contrast, a dose of 25 nM astaxanthin decreased (P <0.05) GPx activity in cumulus cells independent of temperature. The activity of SOD was stimulated (P < 0.05) in the control group oocytes matured with 25 nM astaxanthin compared to 0 nM astaxanthin. The dose of 12.5 nM astaxanthin stimulated (P <0.05) the SOD activity in the group of oocytes thermal shock compared to the same dose in the control group. The profile of SOD activity in cumulus cells varied with dose. While the dose of 12.5 nM astaxanthin inhibited the SOD dose of 25 nM stimulated the activity of SOD in thermal shock group. There was a trend (P = 0.09) in a dose of 12.5 nM astaxanthin increase in CAT activity in oocytes only during thermal shock. We also observed a trend of dose of 12.5 nM astaxanthin to increase (P = 0.09) the formation of MDA/TBA in thermally stressed animals compared with the same dose for the temperature control . In conclusion , the thermal shock affect oocyte competence and astaxanthin reversed this effect rescuing the oocyte competence. It is possible that this effect of astaxanthin was mediated by an increase in the activity of GPX, SOD and CAT enzyme in oocytes subjected to thermal shock. The pathways by which this antioxidant exerts termoprotetor effect have not been fully understood.