Panorama da resistência à polimixina b em isolados clínicos de klebsiella pneumoniae obtidos em um complexo hospitalar da cidade de São Paulo

Abstract

Klebsiella pneumoniae is a ubiquitous microorganism of great importance in the hospital setting due to their ability to acquire antimicrobial resistance, including polymyxins. This study is divided in two manuscripts: Article 1 ? The aim was to evaluate the mechanisms involved in resistance to polymyxin B among K. pneumoniae isolates belonged to the same clonal pattern. A total of 14 isolates recovered from blood cultures of seven distinct hospitalized patients, being one isolate susceptible and another resistant to polymyxin B, were evaluated. The minimum inhibitory concentration to polymyxin B was confirmed by broth microdilution, and for the other antimicrobials, the susceptibility testing was performed by Phoenix® automated system. All 14 isolates were resistant to the broad-spectrum cephalosporins, ciprofloxacin and combination beta-lactams beta-lactamase inhibitors. The blaKPC-2 gene was detected in 12/14 K. pneumoniae isolates. Both isolates from each patient had their genetic similarity confirmed by PFGE. The pmrA, pmrB, pmrD, phoB, phoQ, and mgrB genes were sequenced and compared. Among the seven polymyxin B-resistant isolates, five showed modifications in mgrB. Four of them showed the presence of insertion sequences (IS903b and ISKpn13) inactivating this gene, and one isolate presented a deletion of 12 nucleotides in the mgrB. Mutations in PhoP and PmrB proteins, which belong to the two-component systems PmrAB and PhoPQ, have also been observed separately in two polymyxin B-resistant isolates. These results demonstrated that the polymyxin B resistance may occur during therapy with this antimicrobial agent leading to the therapeutic failure, especially by mobilization of IS that inactivate the mgrB. Article 2 - This study aimed to assess the emergence and spread of polymyxin B-resistant K. pneumoniae clones during seven years in a Brazilian teaching hospital. A total of 54 K. pneumoniae isolates, being 36 resistant and 18 susceptible to polymyxin B, were obtained from blood cultures of hospitalized patients admitted between 2009 and 2015. The bacterial identification was carried out by MALDI-TOF MS and the antimicrobial susceptibility profile was determined by broth microdilution except for fosfomycin, to which the agar dilution method was performed. The clonal relationship of the isolates was assessed by PFGE. Detection of genes encoding beta-lactamases and 16S rRNA methyltransferases, as well the mgrB and mrc-1 genes, related to polymyxin resistance was performed by PCR using specific primers. During the study period, polymyxin B resistance rate in K. pneumoniae increased 30.6% from 2009 to 2015. Changes in mgrB gene were detected in 33.3% of polymyxin B-resistant isolates. However, none of the isolates carried the mcr-1 plasmid gene. Regarding resistance to beta-lactams, high levels of resistance were observed for carbapenems (>88.9%), 3rd and 4th generation cephalosporins (94.4%) and piperacillin/tazobactam (97.2%). The most active drug against polymyxin B-resistant K. pneumoniae isolates was gentamicin, followed by tigecycline (52.8% of sensitivity), and fosfomycin (50.0% sensitivity). The majority of polymyxin B-resistant K. pneumoniae isolates was classified as extensively drug-resistant (XDR), and one isolate was classified as pan-drug resistant (PDR). The blaKPC-2 gene was observed in 77.8% of K. pneumoniae isolates resistant to polymyxin B. Distinct resistant determinants (blaSHV-like genes blaTEM-like, blaCTX-M-1/2-like, and blaCTX-M-14-like) were also detected in such isolates. In addition, the rmtB gene, related to high-level resistance to aminoglycosides, was detected in six isolates obtained from the year 2014. The analysis of clonal relationship showed the existence of ten different clonal groups among K. pneumoniae isolates circulating during 2009 to 2015. In 2014, the XDR clone C7, carrying blaSHV-like, blaTEM-like, blaKPC-2, blaCTX-M-1/2-like, blaCTX-M-14-like, and rmtB, emerged in the hospital setting and spread in the following year.

Klebsiella pneumoniae é um micro-organismo ubíquo e de grande importância hospitalar devido a sua capacidade de adquirir resistência aos antimicrobianos, incluindo as polimixinas. A presente tese está dividida em dois artigos científicos. Artigo 1 ? O objetivo foi avaliar os mecanismos envolvidos na resistência à polimixina B comparando-se isolados de K. pneumoniae clonalmente relacionados. Neste estudo, 14 isolados provenientes de hemoculturas de sete pacientes internados, sendo um isolado sensível e outro resistente à polimixina B, foram avaliados. Todos os isolados tiveram as concentrações inibitórias mínimas para polimixina B confirmada por microdiluição em caldo e para os demais antimicrobianos, o teste de sensibilidade foi realizado pelo sistema automatizado Phoenix®. Todos os 14 isolados apresentaram resistência às cefalosporinas de amplo espectro, às associações com inibidores de betalactamases e ao ciprofloxacino. O gene blaKPC-2 foi detectado em 12/14 isolados de K. pneumoniae avaliados. Ambos os isolados de cada paciente tiveram sua clonalidade confirmada pela técnica de PFGE e tiveram os genes pmrA, pmrB, pmrD, phoB, phoQ e mgrB, relacionados à resistência às polimixinas, sequenciados e comparados entre si. Dos sete isolados resistentes à polimixina B avaliados, cinco apresentaram alterações no gene mgrB. Destes, quatro apresentaram sequências de inserção (IS903b e ISKpn13) inativando o gene em questão, e em um isolado, verificou-se a deleção de 12 nucleotídeos no gene. Mutações nas proteínas PmrB e PhoP, que compõem os sistemas de dois componentes PmrAB e PhoPQ, também foram observadas separadamente em outros dois isolados resistentes à polimixina B. Esses resultados demonstram que a resistência à polimixina B pode ocorre durante a terapia com esse antimicrobiano, levando a falha terapêutica, principalmente pela mobilização de IS inativando o gene mgrB. Artigo 2 ? Neste estudo, o objetivo foi avaliar a emergência e a disseminação de clones de K. pneumoniae resistentes à polimixina B em um hospital universitário brasileiro durante um período de sete anos. Um total de 54 isolados de K. pneumoniae, sendo 36 resistentes e 18 sensíveis à polimixina B, foram obtidos de hemoculturas provenientes de pacientes internados no período de 2009 a 2015. A identificação bacteriana foi realizada por MALDI-TOF MS e o perfil de sensibilidade foi determinado por microdiluição em caldo, exceto para fosfomicina, para a qual foi realizada a técnica de ágar diluição. A relação clonal dos isolados foi avaliada pela técnica de PFGE. A detecção de genes codificadores de betalactamases e de 16S RNAr metiltransferases, bem como dos genes mgrB e mrc-1, relacionados à resistência às polimixinas, foi realizada pela reação em cadeia da polimerase(PCR) utilizando primers específicos. Durante o período de estudo, a taxa de resistência à polimixina B em isolados de K. pneumoniae aumentou 30,6% de 2009 a 2015. Alterações no gene mgrB foram detectadas em 33,3% dos isolados resistentes à polimixina B avaliados no estudo. Entretanto, nenhum dos isolados carreavam o gene plasmidial mcr-1. Em relação à resistência aos betalactâmicos, taxas elevadas de resistência foram observadas para os carbapenêmicos (>88,9%), as cefalosporinas de 3ª e 4ª geração (94,4%) e para piperacilina/tazobactam (97,2%). O antimicrobiano mais ativo contra os isolados de K. pneumoniae resistentes à polimixina B foi a gentamicina, seguido por tigeciclina (sensibilidade de 52,8%) e fosfomicina (sensibilidade de 50,0%). A maioria dos isolados de K. pneumoniae resistentes à polimixina B foi considerada como sendo extensivamente resistente a drogas (XDR), sendo que um isolado foi considerado panresistente (PDR). O gene blaKPC-2 foi observado em 77,8% dos isolados de K. pneumoniae resistentes à polimixina B. Os genes blaSHV-like, blaTEM-like, blaCTX-M-1/2-like e blaCTX-M-14-like também foram detectados. Além disso, o gene rmtB relacionado à resistência de alto nível aos aminoglicosídeos foi encontrado em seis isolados obtidos a partir do ano de 2014. A análise da relação clonal dos isolados mostrou a existência de dez grupos clonais de K. pneumoniae nos últimos sete anos, albergando diferentes determinantes de resistência. Em 2014, o clone C7, carreando os genes blaSHV-like, blaTEM-like, blaKPC-2, blaCTX-M-1/2-like, blaCTX-M-14-like e rmtB, surgiu no hospital de estudo e se disseminou no ano seguinte.