Caracterização funcional de um novo inibidor de cisteínopeptidases, denominado rmcistatina-3, encontrado em hemócitos do carrapato rMicroplus

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Data
2015-05-27
Autores
Lu, Stephen [UNIFESP]
Orientadores
Tanaka, Aparecida Sadae Tanaka [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Objective: Functional characterization of a new cysteinepeptidase inhibitor, named Rmcystatin-3, from hemoyctes of R. microplus. Methods: The Rmcystatin-3 DNA was cloned in the expression vector pPICZaB and expressed in the yeast system using P. pastoris. The rRmcystatin-3 was purified from yeast supernatant by a ionic exchange chromatography followed by a size exclusion chromatography and them biochemically characterized towards different cysteinopeptidases. In order to understand the role of Rmcystatin-3 in tick physiology, we evaluated the mRNA expression in tick tissues using qPCR, also western blot assays were performed to determine the native inhibitor localization. Also Rmcystatin-3 gene silenced was carry out by RNA interference and the hemolymph of silenced and non-silenced ticks analysed by mass spectrometry. Results: The inhibitor expression in P. pastoris yield 35 mg/L and rRmcystatin-3 was able to inhibit cathepsin L (Ki = 2.48 nM), BmCI-1 (Ki = 1.8 nM) and cathepsin B (Ki = 136 nM). Rmcystatin-3 mRNA was mainly identified in hemocytes but also in fat body and salivary gland, although western blot experiments revealed the presence of the native inhibitor only in hemocytes and fat body. Ticks challenged with gram-negative bacteria (E.coli) showed a drastic down-regulation of Rmcystatin-3 mRNA, and ticks who also had Rmcystatin-3 gene silenced, displayed a reduction in bacterias CFU in their hemolymph, compared to control group. In order to identify Rmcystatin-3 physiological target we perform the analysis of the hemolymph from silenced and non-silenced ticks by mass spectrometry, although we were not able to identify the differentially expressed proteins. Conclusion: Taking together the localization of Rmcystatin-3 em hemocytes with the data from RNAi experiments, we propose that Rmcystatin-3 acts as a negative modulator of tick immune response, inhibiting a cysteinepeptidase wich is responsible for the production of immune effector molecules.
Objetivo: Caracterização funcional de um inibidor de cisteínopeptidase, denominado de Rmcistatina-3. Métodos: Inicialmente o DNA que codifica a Rmcistatina-3 foi cio nado em vetor de expressão. O inibidor recombinante foi expresso em levedura P. pastoris em seguida, a proteína recombinante foi purificada por cromatografias de troca iônica e exclusão molecular. A rRmcistatina-3 purificada foi caracterizada cineticamente frente diferentes cisteínopeptidases. Com o objetivo de entender o papel da Rmcistatina-3 na fisiologia do carrapato determinamos a localização da transcrição do inibidor por qPCR, bem como da proteína nativa por Western blot, nos diferentes tecidos do carrapato. Os ensaios de silenciamento gênico de Rmcistatina-3 foram realizados utilizando a técnica de RNA de interferência. E a análise da hemolinfa dos animais silenciados foi realizada por espectrometria de massa. Resultados:. A expressão da rRmcistatina-3 em leveduras foi de aproximadamente 35 mg/L. O inibidor recombinante purificado apresentou constantes de inibição para catepsina L (Ki = 2,48 nM ), BmCI-1 (Ki = 1,8 nM ) e catepsina B (Ki = 136 nM ). Os transcritos correspondentes a Rmcistatina-3 foram encontrados, majoritariamente, em hemócitos e em menor concentração, no corpo gorduroso e glândulas salivar, entretanto ensaios de western blot revelaram a presença da proteína nativa apenas em hemócitos e corpo gorduroso. Ensaios de infecção por bactérias gram-negativas (E. coli; revelaram uma drástica modulação negativas do mRNA da Rmcistatina-3, e carrapatos desafiados com E. coli que tiveram a Rmcistatina-3 silenciada apresentaram número menor de CFU's na hemolinfa comparado com carrapatos controle. Na tentativa de identificar o possível alvo fisiológico da Rmcistatina-3, realizamos ensaios de espectrometria de massa com a hemolinfa dos animais silenciados e não-silenciados, entretanto não foi possível identificar as proteínas diferencialmente expressas. Conclusão: Com base na localização da Rmcistatina-3 associado aos resultados obtidos por silenciamento gênico durante o desafio com bactérias gram-negativas, postulamos que a Rmcistatina-3 atua como um modulador negativo da reposta imune do carrapato R. microplus, regulando a xii atividade proteolítica de uma cisteínopeptidase responsável pela produção de moléculas responsáveis pelo controle de bactérias.
Descrição
Citação
LU, Stephen. Caracterização funcional de um novo inibidor de cisteínopeptidases, denominado rmcistatina-3, encontrado em hemócitos do carrapato rMicroplus. 2015. 70 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.