Hipóxia induzida por adesão ao plástico utilizado em modelo de cocultura celular
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Data
2015-08-12
Autores
Cunha, Gabriel Lopes Argello [UNIFESP]
Orientadores
Nader, Helena Bonciani Nader [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
In vitro cell culture was a revolutionary event on biological sciences. Yet another essential moment was the replacement of glass vessels by plastic materials, which occurred when treatments to make plastic suitable for cell adhesion were developed. ?Culture treated? plastics are prepared in numerous ways, all aiming to chemically transform the hydrophobic plastic surface into a hydrophilic, cell culture sustaining substrate. However, there are few studies focused on understanding the effect of such surfaces on cell metabolism. Therefore, the goal of the present study was to analyze the behavior of endothelial cell cultures grown on such plastic permeable supports (tissue culture polyethylene terephthalate ? TCPET), focusing on the synthesis and secretion of glycosaminoglycans (GAGs) by such cells. It is known that such GAGs play important roles in several cellular processes. Heparan sulfate (HS) can bind and modulate the activity of proteins involved in cell adhesion, cell proliferation, cell growth, tumor formation, hemostasis among others. It is well established that the exposure of endothelial cells to heparin stimulates the synthesis of an antithrombotic HS. Since the characteristic antithrombotic HS of endothelial cells is shedded to the medium this study also aimed to analyze the vectorial secretion of GAG by TCPET cultured ECs. GAG biosynthesis analyzed by incorporation of [35S]-sulfate in GAG chains showed that EC TCPET cultures have a 4 fold increase in cell surface HS, and present a vectorial GAG secretion pattern, in which over 95% of all secreted GAG is addressed to the luminal environment, and only residual GAG amounts were observed in the basal compartment. The overall increase in GAG synthesis led to the analysis of metabolites produced by TCPET cultured cells using proton nuclear magnetic resonance (H1-NMR) and principal component analysis (PCA). The NMR determined an increase in lactate and choline in TCPET cells compared to the regular vessel used made from polystyrene (TCPS). The lactate increase is a strong marker for hypoxia and experiments using conditioned culture medium determined that the hypoxic phenotype developed is restricted to cells adhered to the TCPET substrate. The use of confocal microscopy to study important molecules for cell structure, adhesion and metabolism was challenging since we were able to observe interference from the TCPET on the equipment laser. The same problem was encountered when CARS microscopy was tried to better examine lipid trafficking on TCPET cultured cells. Scanning electron microscopy showed a great number of bubbles on endothelial cell membranes adhered to TCPET. Taken together, the results demonstrate endothelial and smooth muscle cells undergoing a hypoxic state that is associated with cell adhesion to the cell culture treated PET.
O cultivo celular in vitro foi um evento revolucionário para as ciências biológicas. Outro momento essencial foi a substituição dos recipientes de vidro por materiais plásticos, o que ocorreu quando se desenvolveu uma técnica capaz de tornar os substratos plásticos favoráveis à adesão de células dependentes de contato. Essa preparação dos plásticos pode ser feita de diversas maneiras, mas todas visam transformar quimicamente as superfícies de cultivo dos recipientes em regiões hidrofílicas para permitir a adesão celular. Há, no entanto, poucos estudos dedicados a analisar os efeitos dessas superfícies no metabolismo celular. O presente trabalho teve como objetivo estudar o comportamento de células endoteliais (EC) polarizadas em suportes porosos plásticos tratados para cultura celular (TCPET), que isola os produtos de secreção das superfícies apical e basolateral das células. Em especial, buscou-se analisar a síntese e secreção de glicosaminoglicanos (GAGs), moléculas fundamentais para muitos processos celulares, por incorporação de [35S]-sulfato em culturas de células endoteliais (ECTCPET) e células musculares lisas (SMC-TCPET). Essas culturas foram comparadas ao cultivo em placas de cultura de poliestireno (TCPS; EC-TCPS e SMC-TCPS). Em EC-TCPET observou-se aumento de quatro vezes no HS da fração celular. Também foi descrito um padrão de secreção vetorial de GAGs, no qual mais de 95% do total de glicosaminoglicanos sulfatados foi secretado para o equivalente ao lúmen celular. SMC-TCPET demonstrou um aumento de dez vezes para HS, condroitim e dermatam sulfato (CS/DS) secretados para o compartimento apical. A fração celular de SMC-TCPET registrou aumentos de cinco e dez vezes, respectivamente, para HS e CS/DS. Ainda, culturas SMC-TCPET secretaram quantidades significativas de GAGs para o compartimento basal, validando o fenótipo de secreção vetorial de GAGs por ECs polarizadas. Análises de metabolômica por ressonância magnética nuclear de próton (1H-NMR) seguida da análise de componente principal (PCA) para as diferentes culturas mostrou um aumento significativo de lactato e colina comparado-se EC-TCPET com EC-TCPS, indicando um fenótipo de hipóxia. A observação por microscopia eletrônica de varredura (MEV) das culturas em TCPET evidenciou bolhas na membrana plasmática, outro fenômeno conhecido em casos de hipóxia. A análise de proteínas importantes para estrutura, adesão e metabolismo celular por microscopia confocal foi problemática, pois o TCPET causou interferência no laser do equipamento. A mesma dificuldade técnica foi observada ao se analisar as células por microscopia CARS. No entanto, análises por microscopia CARS do substrato plástico TCPET é quimicamente distinto do PET. Consequentemente, é importante obsevar se o TCPET causa alterações fisiológicas na linhagem celular a ser estudada. Somente assim pode-se distinguir entre efeitos reais e artefatos provenientes da adesão a esse material.
O cultivo celular in vitro foi um evento revolucionário para as ciências biológicas. Outro momento essencial foi a substituição dos recipientes de vidro por materiais plásticos, o que ocorreu quando se desenvolveu uma técnica capaz de tornar os substratos plásticos favoráveis à adesão de células dependentes de contato. Essa preparação dos plásticos pode ser feita de diversas maneiras, mas todas visam transformar quimicamente as superfícies de cultivo dos recipientes em regiões hidrofílicas para permitir a adesão celular. Há, no entanto, poucos estudos dedicados a analisar os efeitos dessas superfícies no metabolismo celular. O presente trabalho teve como objetivo estudar o comportamento de células endoteliais (EC) polarizadas em suportes porosos plásticos tratados para cultura celular (TCPET), que isola os produtos de secreção das superfícies apical e basolateral das células. Em especial, buscou-se analisar a síntese e secreção de glicosaminoglicanos (GAGs), moléculas fundamentais para muitos processos celulares, por incorporação de [35S]-sulfato em culturas de células endoteliais (ECTCPET) e células musculares lisas (SMC-TCPET). Essas culturas foram comparadas ao cultivo em placas de cultura de poliestireno (TCPS; EC-TCPS e SMC-TCPS). Em EC-TCPET observou-se aumento de quatro vezes no HS da fração celular. Também foi descrito um padrão de secreção vetorial de GAGs, no qual mais de 95% do total de glicosaminoglicanos sulfatados foi secretado para o equivalente ao lúmen celular. SMC-TCPET demonstrou um aumento de dez vezes para HS, condroitim e dermatam sulfato (CS/DS) secretados para o compartimento apical. A fração celular de SMC-TCPET registrou aumentos de cinco e dez vezes, respectivamente, para HS e CS/DS. Ainda, culturas SMC-TCPET secretaram quantidades significativas de GAGs para o compartimento basal, validando o fenótipo de secreção vetorial de GAGs por ECs polarizadas. Análises de metabolômica por ressonância magnética nuclear de próton (1H-NMR) seguida da análise de componente principal (PCA) para as diferentes culturas mostrou um aumento significativo de lactato e colina comparado-se EC-TCPET com EC-TCPS, indicando um fenótipo de hipóxia. A observação por microscopia eletrônica de varredura (MEV) das culturas em TCPET evidenciou bolhas na membrana plasmática, outro fenômeno conhecido em casos de hipóxia. A análise de proteínas importantes para estrutura, adesão e metabolismo celular por microscopia confocal foi problemática, pois o TCPET causou interferência no laser do equipamento. A mesma dificuldade técnica foi observada ao se analisar as células por microscopia CARS. No entanto, análises por microscopia CARS do substrato plástico TCPET é quimicamente distinto do PET. Consequentemente, é importante obsevar se o TCPET causa alterações fisiológicas na linhagem celular a ser estudada. Somente assim pode-se distinguir entre efeitos reais e artefatos provenientes da adesão a esse material.
Descrição
Citação
CUNHA, Gabriel Lopes Argello. Hipóxia induzida por adesão ao plástico utilizado em modelo de cocultura celular. 2015. 116 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.