Fator de transcrição e2f2 e tumorigenicidade de células-tronco embrionárias humanas

Abstract

Tumorigenicity is one major biosafety concern regarding stem cell application in therapeutic protocols. In this sense, human embryonic stem cells (hESC) are a classic example. Although hESC are attractive candidates for use in cell therapy, their ability to form teratomas is well known, limiting their clinical application. Recent studies of our group have identified aberrant expression of the E2F2 gene in cancer stem cells, which was found associated with increased tumor malignancy. The E2F2 gene is involved in the control of cell cycle and embryonic development. In this study, we tested whether knockdown of E2F2 would affect hESC self-renewal and formation of teratomas, based on its direct (cell cycle control) and indirect (expression regulation of target proto-oncogenes) effects. A transient but efficient E2F2 silencing was obtained in hESC, which significantly inhibited expression of the proto-oncogenes BMI1 and HMGA1, but did not affect expression of c-MYC, MELK and b–MYB. The morphology of silenced cells (shE2F2) was similar to those of non-silenced control cells (hESC) and of cells transfected with non-specific DNA (CT-). Proliferation of shE2F2 cells was significantly inhibited compared to control cells, as indicated by a reduced ability to generate new cell colonies in vitro and by a greater proportion of cells in G1 phase and a lower proportion of cells in G2 / M phase of the cell cycle. Nonetheless, E2F2-silenced cells kept typical expression of intra-nuclear (NANOG, OCT4 and SOX2) and surface membrane (HESCA + / SSEA4 + / SSEA1 - profile) pluripotency markers, as well as the staining pattern based on alkaline phosphatase activity. E2F2-silenced cells also kept their competence of spontaneous differentiation (formation of embryoid bodies) and neural differentiation in vitro. More importantly, E2F2 knockdown in hESC significantly inhibited tumor growth in vivo, which were considerably smaller than tumors generated from control hESC, albeit displaying typical teratoma traits, a major indicator of pluripotency retention in E2F2-silenced cells. These results suggest that E2F2 knockdown can inhibit hESC proliferation and tumorigenicity without significantly harming stemness, providing a rationale to future protocols aiming at minimizing risks related to therapeutic application of cells and/or products derived from human pluripotent cells.

Um dos principais questionamentos acerca da biossegurança de células-tronco é a geração de tumores. Nesse sentido, as células-tronco embrionárias humanas (CTEh) constituem um exemplo clássico. Embora sejam atraentes candidatas ao emprego em terapia celular, a capacidade das CTEh em formar teratomas é bem reconhecida, limitando sua aplicação clínica. Estudos recentes do nosso grupo identificaram expressão aberrante do gene E2F2 em células-tronco neoplásicas, relacionada ao grau de malignidade tumoral. O gene E2F2 está envolvido no controle do ciclo celular e do desenvolvimento embrionário de mamíferos. Neste estudo, testamos se a inibição do gene E2F2 é capaz de reduzir a auto-renovação de CTEh e a consequente formação de teratomas, com base em seus efeitos diretos (sobre o ciclo celular) e indiretos (sobre a expressão de proto-oncogenes alvos). Obteve-se um silenciamento transitório, porém significativo de E2F2 em CTEh, o qual também reduziu significativamente a expressão dos proto-oncogenes BMI1 e HMGA, mas não afetou a expressão de c-MYC, MELK e b-MYB em CTEh. As células silenciadas (shE2F2) apresentaram características morfológicas semelhantes às de células controles não-silenciadas (CTEh) e de células transfectadas com DNA não-específico (CT-). As células shE2F2 apresentaram uma proliferação significativamente reduzida, indicada por uma menor capacidade de gerar novas colônias celulares in vitro, por maior proporção de células em fase G1 e por menor proporção de células em fase G2/M do ciclo celular. Entretanto, as células silenciadas mantiveram inalterado o perfil de expressão de marcadores de pluripotência intra-nucleares (NANOG, OCT4 e SOX2) e de superfície de membrana (perfil HESCA+/SSEA4+/SSEA1-), bem como o padrão de coloração com base na atividade de fosfatase alcalina. A capacidade de diferenciação espontânea (formação de corpos embrióides) e de diferenciação neurogênica in vitro também foram preservadas nas células shE2F2. Notadamente, o silenciamento de E2F2 inibiu significativamente a capacidade de CTEh em gerar tumores in vivo. Embora subdesenvolvidos, os tumores derivados de células shE2F2 exibiram características típicas de teratomas, indicando preservação de pluripotência. Esses resultados fundamentam o envolvimento do gene E2F2 no controle da auto-renovação e tumorigenicidade de CTEh. Tais achados sugerem que a capacidade tumorigênica de CTEh pode ser suprimida sem prejuízos significativos à pluripotência e ao potencial de diferenciação celular, levantando possíveis implicações quanto à segurança do uso terapêutico de células especializadas, derivadas de células pluripotentes de origem humana.