Estudo funcional dos genes dcc em nas linhagens celulares de mieloma múltiplo

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Data
2014-07-30
Autores
Rodrigues Junior, Dorival Mendes [UNIFESP]
Orientadores
Oliveira, Andre Luiz Vettore de Oliveira [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
BACKGROUND: Multiple myeloma (MM) is a B cells neoplasm, described as incurable, characterized by multiple organ failure due to bone marrow infiltration by malignant cells and systemic damage caused by circulating monoclonal proteins. It is believed that the identification of new molecular markers can aid in determining the prognosis and selecting more appropriate therapy approaches, contributing to improvements in the survival rate of MM patients. Previous data demonstrated that aberrant methylation of the DCC gene is significantly correlated with survival rate of patients affected by MM. The DCC protein belongs to the family of netrin-1 receptors and participates in the control of apoptosis. However, there is a lack of studies evaluating the DCC involvement in MM tumorigenesis processo OBJECTIVES: The main goals of this study are (1) to understand the DCC biological role in MM tumorigenesis and (2) to assess the impact of DCC inhibition in MM cell lines treated with bortezomib, the standard drug used in the MM treatment. MATERIALS AND METHODS: The DCC gene expression was assessed by RT-PCR and qRT-PCR, the promoter methylation profile ofthis gene was determined by MSP and qMSP, and the presence of DCC protein was verified by Western blotting (WB). The DCC was silenced by esiRNA and assays were conducted to evaluate the impact of DCC absence in cell viability and apoptosis. RESUL TS: The presence of DCC promoter methylation in RPMI8226 cell line was detected, and, as expected, this cell line did not presented expression of DCC mRNA or DCC protein. On the other hand, DCC methylation was not observed in the U266 cell line, and DCC transcripts and DCC protein were detected. The DCC was silenced in this cell line and the absence of this protein showed a significant reduction in the cell viability after treatment with Bortezomibe (p < 0.0001) could be noted. Furthermore, the transient silencing of DCC expression in U266 leads to an increase in the population of apoptotic cells (p < 0.0001). CONCLUSION: These results demonstrate that DCC promoter methylation is an important mechanism of gene expression regulation in MM and the expression of this gene can influence cell viability and apoptosis. Key-words: Apoptosis, Bortezomib, Cell viability, DCC, DNA aberrant methylation, Multiple Myeloma
Introdução: o mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia de células B, descrita como incurável, caracterizada pela disfunção de múltiplos órgãos devido à infiltração da medula óssea por células malignas e dano sistêmico causado por proteínas monoc1onais circulantes. Acredita-se que a identificação de novos marcadores moleculares pode auxiliar na determinação do prognóstico e na escolha da terapia mais adequada, contribuindo para a melhora na expectativa de vida dos pacientes com MM. Dados prévios demonstram que a metilação aberrante do gene DCC influi, significativamente, na taxa de sobrevida dos pacientes acometidos por MM. Sabe-se que a proteína DCC pertence à família de receptores de netrina-l e participa do controle da apoptose, contudo, há escassez de estudos avaliando a participação desta proteína no processo de tumorigênese do MM. Objetivos: este estudo visou (1) compreender o papel biológico desempenhado pelo DCC na tumorigênese do MM e (2) avaliar o impacto do silenciamento do DCC em linhagens de MM tratadas com bortezomibe, a droga-padrão utilizada no tratamento dos pacientes com MM. MATERIAIS E Métodos: a expressão do gene DCC foi avaliada por RT-PCR e qRT-PCR e o perfil de metilação do promotor deste gene foi determinado através de ensaios de MSP e qMSP. Além disto, o gene DCC foi silenciado por esiRNA, a presença da proteína DCC foi avaliada por Western Blotting (WB) e o impacto da ausência do DCC na viabilidade e na apoptose foi verificado. Resultados: foi detectada a presença de metilação do promotor do gene DCC na linhagem RPMI-8226, sendo que esta linhagem não apresentou expressão de mRNA e de proteína DCC. Por outro lado, não foi observada metilação do DCC na linhagem U266, na qual foi detectada a presença de transcritos e da proteína DCC. Diante disto, o gene DCC foi silenciado nesta linhagem celular e os ensaios funcionais demonstraram que na ausência do DCC, há uma redução significativa no número de células viáveis comparadas com a linhagem selvagem após o tratamento com bortezomibe (p < 0,0001). Além disto, foi observado que o silenciamento transiente da expressão do DCC na linhagem celular U266 leva a um significativo aumento na população de células apoptóticas (p < 0,0001). Conclusão: OS resultados demonstram que a metilação do promotor do DCC é um importante mecanismo regulador da expressão deste gene em MM e que o silenciamento deste gene diminui a viabilidade celular e aumenta o número de células apoptóticas em resposta ao tratamento com bertozomibe.
Descrição
Citação
RODRIGUES JUNIOR, Dorival Mendes. Estudo funcional dos genes dcc em nas linhagens celulares de mieloma múltiplo. 2014. 42 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.