Incorporação de análogos de triptofano volumosos em proteínas recombinantes expressas em sistemas heterólogos que utilizam a t7 rna polimerase
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Data
2015-02-26
Autores
Souza, Wellington Pimentel de Oliveira [UNIFESP]
Orientadores
Oliveira, Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandao de Oliveira [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
A incorporação de aminoácidos não canônicos é uma estratégia atrativa para a introdução de novas propriedades químicas e físicas em proteínas recombinantes. O presente trabalho teve como objetivo principal, o desenvolvimento de um sistema para a incorporação de análogos de triptofano em proteínas recombinantes expressas em E. coli. A incorporação de análogos de triptofano (7-aza-triptofano, 5-hydroxi-triptofano e 5-fluoro-triptofano) vem sendo usada como ferramenta em análises espectroscópicas. Pois tais análogos possuem perfis de espectro e absorbância diferentes de aminoácidos naturais. Alguns poucos análogos de triptofano foram incorporados biossinteticamente em proteínas utilizando E. coli como sistema de expressão. De maneira geral usam-se cepas de E. coli auxotróficas para o triptofano. O crescimento bacteriano é feito com uma concentração baixa triptofano em meio mínimo, o suficiente para que não haja morte celular, forçando o resquício bacteriano usar o resto celular de fonte degradada, para síntese de proteínas. Após obter uma biomassa satisfatória é feito uma lavagem para retirar o triptofano remanescente, adiciona-se o análogo, assim promovendo a expressão da proteína, induzido a incorporação do aminoácido não natural no lugar do triptofano. O sistema de expressão mais usado no mundo, é baseado no sistema pET (EMD-Millipore), que possui o promotor T7. Em um vetor com o domínio do forte promotor T7, insere-se o gene da proteína de interesse, fazendo o controle estringente da expressão da proteína alvo. Para tal gerência é usado uma cepa ÀDE3 lisogênica, que promove, sob o controle do promotor UV5, a expressão da enzima T7 polimerase. A incorporação de análogos contendo grupamentos mais volumosos em proteínas sempre foi um objetivo perseguido por diversos grupos, porém sem muito sucesso. O que verificamos no início deste trabalho é que na tentativa de incorporar o do análogo 5-hydroxitriptofano em proteínas alvo, foi que tal resíduo acaba sendo incorporado na estrutura da própria T7 polimerase tornando esta enzima inativa. Tal fato se torna um obstáculo já que um aminoácido não natural pode atrapalhar o enovelamento e atividade enzimática dessa polimerase, e para o funcionamento do sistema pET há a necessidade de termos a T7 polimerase ativa e com total eficiência em sua ação enzimática. A incorporação do análogo de triptofano na própria T7 polimerase acontece, pois, a T7 polimerase nesses sistemas tem o mesmo controle de expressão, que o gene de interesse (operonlac), controlado pela presença do indutor da expressão IPTG. Descrevemos, portanto metodologias de expressão tentando separar as etapas de expressão da T7 polimerase (na presença de tritofano normal) e da expressão da proteína de interesse (na presença do análogo de triptofano), modificando apenas o protocolo normalmente utilizado, acima resumido. Em testes com uma proteína intrinsecamente desenovelada (o-sinucleína mutante V26W), contendo apenas um resíduo de triptofano em sua sequência para não termos o fator enovelamento da proteína, como mais um fator a ser contornado, e obtivemos uma eficiência de incorporação (5-hydroxi-triptofano/triptofano) em torno de 80%. Para aumentar essa eficiência pretendemos numa continuidade deste trabalho também desenvolver vetores e cepas auxotróficas, visando um sistema cujo controle de expressão da T7 polimerase seja diferente do controle do gene da proteína de interesse
Descrição
Citação
SOUZA, Wellington Pimentel de Oliveira. Incorporação de análogos de triptofano volumosos em proteínas recombinantes expressas em sistemas heterólogos que utilizam a t7 rna polimerase. 2015. 54 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.