Novas proteínas de interação da spag11b/c: identificação, expressão celular e regulação androgênica no epidídimo
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Data
2014-02-28
Autores
Pelosi, Pamella Aparecida Jacon [UNIFESP]
Orientadores
Avellar, Maria Christina Werneck de Avellar [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Introdução: O epidídimo é um tecido do trato reprodutor masculino importante para o transporte, maturação, estocagem e proteção do espermatozoide. A literatura tem evidenciado a capacidade do epitélio epididimário expressar e secretar diferentes proteínas antimicrobianas da família das ?-defensinas, entre elas produtos de splicing alternativo do gene Sperm-associated antigen 11B (SPAG11B), expressos em diferentes espécies e que constituem um componente importante na imunidade inata contra patógenos. Há também evidências de que as ?-defensinas tenham efeitos diretos no espermatozoide epididimário e do ejaculado, além de interferir com a interação deste com o ovócito, sugerindo serem proteínas multifuncionais, com implicação na fertilidade masculina. Apesar de antimicrobianos in vitro, o papel in vivo dos produtos do gene SPAG11B ainda não é conhecido. Identificamos por ensaios de duplo híbrido em levedura 171 clones de cDNA que interagem com a isoforma C do gene SPAG11B humano (hSPAG11B/C). Dentre esses, 8 foram selecionados para posterior análise. Objetivos: 1) Confirmar por ensaios de duplo híbrido em levedura, proteínas de interação com a isoforma hSPAG11B/C e identificar as regiões proteicas envolvidas; 2) Caracterizar a expressão e distribuição celular de GLRX3 e da SPAG11B/C (RNAm e proteína) em tecidos periféricos reprodutivos e não reprodutivos de rato e de GLRX3 em epidídimo humano e 3) Caracterizar a regulação por androgênios da expressão e distribuição celular da GLRX3 (RNAm e proteína) no epidídimo de rato adulto. Métodos: Ensaios de duplo híbrido one by one em levedura foram realizados usando a hSPAG11B/C (inteira, Nou C-terminal), hSPAG11B/D e hSPAG11B/E como isca (ligados ao vetor pBTM- 116) e proteínas codificadas pelos 8 clones de cDNA (incluindo hGLRX3 inteira, C- e N-terminal) usadas como presa (ligados ao vetor pGAD-C1). As interações positivas foram observadas pelos genes repórteres HIS3 e LacZ. A expressão dos genes Spag11b/c e Glrx3 foi analisada por RT-PCR semi-quantitativo ou em tempo real. Ensaios de Western blot (WB; para GLRX3) e de imuno-histoquímica (IHC; para SPAG11B/C e GLRX3) foram também realizados. Resultados e Discussão: Observamos uma interação positiva entre a hSPAG11B/C (inteira e região Cterminal), mas não hSPAG11B/D e hSPAG11B/E, com a hGLRX3 inteira. Ensaios de RT-PCR e WB revelaram a expressão constitutiva da GLRX3 em tecidos reprodutivos e não reprodutivos de ratos adultos, enquanto RNAm Spag11b/c mostrou expressão restrita a tecidos reprodutivos, com maior abundância na cabeça do epidídimo. A expressão de transcritos da Glrx3 não variou com o desenvolvimento do animal, mas foi reduzida após a castração por 1-15 dias, um efeito não revertido por testosterona, indicando que fatores testiculares estejam envolvidos na modulação da expressão desse gene. Por outro lado, em termos proteicos, não houve alteração da expressão da GLRX3 com o status androgênico do rato adulto. Observou-se uma co-localização da SPAG11B/C e GLRX3 no epitélio e na musculatura lisa que circunda o ducto epididimário de ratos e humanos. Ensaios de bioinformática foram também iniciados para determinação da modelagem tridimensional por homologia da região C-terminal da hSPAG11B/C, por onde a ligação com GLRX3 foi identificada. Conclusão: Os resultados indicam novas interações para a hSPAG11B/C e uma potencial relação funcional com a hGLRX3. A relevância fisiológica dessa interação e seu papel na função epididimária e na fertilidade masculina deverão ainda ser explorados.
Descrição
Citação
PELOSI, Pamella Aparecida Jacon. Novas proteínas de interação da spag11b/c: identificação, expressão celular e regulação androgênica no epidídimo. 2014. 96 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.