As vias de Cdc42/N-WASP e Rac1/WAVE2 na dinâmica de actina durante a invasão celular pelos amastigotas extracelulares de Trypanosoma cruzi
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Data
2016-11-30
Autores
Melo, Alexis de Sá Ribeiro do Bonfim de [UNIFESP]
Orientadores
Mortara, Renato Arruda [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Título de Volume
Resumo
Host cell invasion by extracellular amastigotes (EA) of Trypanosoma cruzi is highly dependent on actin cytoskeleton of host cells whose regulatory cellular mechanisms are still poorly understood. Cdc42 and Rac1 GTPases are key mediators of the actin cytoskeleton promoting Arp2/3 complex-dependent actin polymerization via activation of their effector proteins, N-WASP and WAVE2, respectively. The aim of this study was to evaluate the participation Cdc42/N-WASP and Rac1/WAVE2 signaling pathways in actin dynamics during EA internazalization in HeLa cells. Using live-cell imaging in confocal microscope it was observed that Cdc42 and Rac1 are recruited to and colocalize with actin during whole period of EA internalisation. GTPases recruitment was sustained in groups expressing active (CA) or inactive (DN) mutant isoforms when compared to native isoforms (WT). When the invasion ability was compared to control groups, the expression of Rac1 CA and Cdc42 WT increased the number of internalized parasites while Rac1 DN and Cdc42 CA expression reduced it. Additionally, the invasion of EAs is inhibited in cells depleted for Rac1 and also recruitment assays using live cells showed delayed invasion despite no effective reduction in amount of polymerized actin at EA invasion sites. For cells depleted for Cdc42 it was observed inhibition of EA internalization in some experiments, but no inhibition in others; live-cell imaging assays also revealed no delay in actin recruitment in this group. In cells depleted for N-WASP and WAVE2 proteins it was also observed inhibition and delay in the internalization without reduction in actin polymerization. Both proteins were also recruited to and colocalized with actin in EA invasion sites. Finally, depletion of four proteins studied did not affect the density or morphology of membrane projections mobilized by AEs as observed by scanning electron microscopy. The overall result confirms the participation of Cdc42/N-WASP and Rac1/WAVE2 signaling pathways in actin dynamics during EA host cell invasion and encourage the study of other proteins possibly cooperating in these pathways.
A invasão celular pelas formas amastigotas extracelulares (AE) de Trypanosoma cruzi é um processo altamente dependente do citoesqueleto de actina do hospedeiro cujos mecanismos celulares regulatórios ainda são pouco conhecidos. As GTPases Cdc42 e Rac1 são mediadores chave do citoesqueleto de actina ao promover a sua polimerização dependente do complexo Arp2/3 por meio da ativação das suas proteínas efetoras, N-WASP e WAVE2, respectivamente. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a participação das vias de Cdc42/N-WASP e Rac1/WAVE2 na dinâmica de actina durante a invasão celular pelos AEs em células HeLa. Utilizando ensaios com células vivas em microscópio confocal foi observado que Cdc42 e Rac1 são recrutadas e colocalizam com actina durante todo o processo de internalização dos AEs. O recrutamento foi mantido nos grupos expressando as isoformas mutantes ativas (CA) ou inativas (DN) das GTPases quando comparadas às isoformas nativas (WT). Já na invasão, quando comparados aos grupos controle, a expressão de Rac1 CA e Cdc42 WT aumentou o número de parasitos internalizados enquanto que a expressão Rac1 DN e Cdc42 CA reduziu. Adicionalmente, a invasão dos AEs é inibida em células depletadas para Rac1 e ensaios de recrutamento com essas células vivas mostraram atraso na invasão sem, entretanto, efetiva redução na quantidade de actina polimerizada nos sítios de invasão desses parasitos. Para as células depletadas para Cdc42 observamos inibição da invasão em alguns experimentos, porém nunhuma inibição em outros; os ensaios com células vivas não revelaram atraso no recrutamento de actina nesse grupo. Para as células depletadas para N-WASP e WAVE2 também foi observada inibição e retardo na internalização sem redução na polimeirização de actina. As duas proteínas também foram recrutadas e colocalizaram com actina nos sítios de invasão dos AEs. Por fim, a depleção das quatro proteínas estudadas não alterou a densidade ou morfologia das microvilosidades de membrana mobilizadas pelos AEs como observado por microscopia eletrônica de varredura. Os resutados confirmam a participação das vias de Cdc42/N-WASP e Rac1/WAVE2 na dinâmica de actina durante a invasão dos AEs e encorajam o estudo de outras proteínas possivelmente coatuando nessas vias.
A invasão celular pelas formas amastigotas extracelulares (AE) de Trypanosoma cruzi é um processo altamente dependente do citoesqueleto de actina do hospedeiro cujos mecanismos celulares regulatórios ainda são pouco conhecidos. As GTPases Cdc42 e Rac1 são mediadores chave do citoesqueleto de actina ao promover a sua polimerização dependente do complexo Arp2/3 por meio da ativação das suas proteínas efetoras, N-WASP e WAVE2, respectivamente. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a participação das vias de Cdc42/N-WASP e Rac1/WAVE2 na dinâmica de actina durante a invasão celular pelos AEs em células HeLa. Utilizando ensaios com células vivas em microscópio confocal foi observado que Cdc42 e Rac1 são recrutadas e colocalizam com actina durante todo o processo de internalização dos AEs. O recrutamento foi mantido nos grupos expressando as isoformas mutantes ativas (CA) ou inativas (DN) das GTPases quando comparadas às isoformas nativas (WT). Já na invasão, quando comparados aos grupos controle, a expressão de Rac1 CA e Cdc42 WT aumentou o número de parasitos internalizados enquanto que a expressão Rac1 DN e Cdc42 CA reduziu. Adicionalmente, a invasão dos AEs é inibida em células depletadas para Rac1 e ensaios de recrutamento com essas células vivas mostraram atraso na invasão sem, entretanto, efetiva redução na quantidade de actina polimerizada nos sítios de invasão desses parasitos. Para as células depletadas para Cdc42 observamos inibição da invasão em alguns experimentos, porém nunhuma inibição em outros; os ensaios com células vivas não revelaram atraso no recrutamento de actina nesse grupo. Para as células depletadas para N-WASP e WAVE2 também foi observada inibição e retardo na internalização sem redução na polimeirização de actina. As duas proteínas também foram recrutadas e colocalizaram com actina nos sítios de invasão dos AEs. Por fim, a depleção das quatro proteínas estudadas não alterou a densidade ou morfologia das microvilosidades de membrana mobilizadas pelos AEs como observado por microscopia eletrônica de varredura. Os resutados confirmam a participação das vias de Cdc42/N-WASP e Rac1/WAVE2 na dinâmica de actina durante a invasão dos AEs e encorajam o estudo de outras proteínas possivelmente coatuando nessas vias.
Descrição
Citação
MELO, Alexis de Sá Ribeiro do Bonfim de. As vias de Cdc42/N-WASP e Rac1/WAVE2 na dinâmica de actina durante a invasão celular pelos amastigotas extracelulares de Trypanosoma cruzi. 2016. 119 f. Tese (Doutorado em Microbiologia e Imunologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.