Análise de expressão gênica e metilação de DNA de pacientes em primeiro episódio psicótico virgens de tratamento

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Data
2015-03-25
Autores
Ota, Vanessa Kiyomi Arashiro [UNIFESP]
Orientadores
Belangero, Sintia Iole Nogueira [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
A esquizofrenia é o transtorno mental mais grave e incapacitante dentre os distúrbios psiquiátricos. A demora em instituir tratamento adequado e a duração do primeiro episódio psicótico estão entre os principais fatores de mau prognóstico da doença. O presente projeto propôs a investigação de marcadores genéticos e epigenéticos para o diagnóstico e tratamento da esquizofrenia por meio do estudo da expressão de genes alvos e do estudo do padrão de metilação de DNA (estudo de expressão gênica I). Paralelamente, em células progenitoras de neurônios, estudamos o efeito do silenciamento do gene MBD5 (Methyl-CpG Binding Domain Protein 5), importante para o neurodesenvolvimento e possivelmente relacionado à metilação de DNA (estudo funcional II). Para o estudo I, pacientes em primeiro episódio psicótico (PEP) virgens de tratamento e controles saudáveis foram submetidos à avaliação clínica e à coleta de sangue periférico. Os pacientes ressubmeteram-se às mesmas avaliações após oito semanas do início do tratamento com risperidona, sendo que parte deles também foram reavaliados após um ano de inclusão na pesquisa. Em todas as etapas de seguimento do estudo, o sangue dos pacientes foi recoletado, seguido pela extração de DNA e RNA das amostras. O estudo de expressão gênica I foi realizado por meio da técnica de PCR em tempo real quantitativo, e a análise metilação por meio de sequenciamento após conversão com bissulfito de sódio. Para o estudo funcional II, o silenciamento do gene MBD5 foi realizado em células progenitoras de neurônios. Elas foram submetidas ao sequenciamento de RNA, PCR em tempo real, Western blotting, e à citometria de fluxo. No estudo I os resultados indicaram uma redução na expressão do gene GCH1 (GTP cyclohydrolase 1) e um aumento na expressão dos genes NDEL1 (nudE neurodevelopment protein 1-like 1) e MBP (myelin basic protein) no sangue de pacientes em PEP quando comparados aos controles. Quando comparamos os pacientes antes e após o tratamento, o gene GABRR2 (gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, rho 2) mostrou-se hipoexpresso após o tratamento com risperidona. Além disso, embora os dados sejam promissores, a expressão de GCH1 não parece ser regulada por metilação de DNA. Quanto ao estudo funcional II, foi observado que o silenciamento do gene MBD5 levava a um desbalanço entre proliferação e diferenciação das células progenitoras de neurônios. Os resultados desse estudo indicaram três genes possivelmente envolvidos na psicose propriamente dita, estando relacionados às vias dopaminérgicas e serotoninnérgicas (GCH1), ao neurodesenvolvimento (NDEL1) e à mielinização (MBP). Além disso, o gene GABRR2, embora não pareça ser alvo direto da risperidona, pode estar associado à resposta ao tratamento ou evolução da doença, indicando, assim, a importância da via GABAérgica. Estes dados poderão futuramente auxiliar a identificação de marcadores biológicos, tanto para a psicose quanto para o tratamento da esquizofrenia, possibilitando uma ação terapêutica precoce e acarretando na redução do tempo de psicose não tratada, o que pode resultar em diminuição da morbidade e melhor qualidade de vida para os pacientes. Também observamos que reduções na expressão de um gene envolvido em doenças do neurodesenvolvimento (MBD5) promovem um estado mais diferenciado que proliferativo de células progenitoras de neurônios, um fenômeno que parece estar presente nas alterações de outros genes envolvidos nessas doenças podendo, assim, ser um mecanismo convergente de doenças do neurodesenvolvimento, como o autismo, a deficiência intelectual e a esquizofrenia.
Schizophrenia is the most severe and disabling mental disorder among psychiatric disorders. The delay in providing appropriate treatment and the duration of the first episode of psychosis (FEP) are among the main factors of poor prognosis of the disease. In this study we investigated genetic and epigenetic markers for the treatment of schizophrenia through the study of the expression of target genes and the pattern of DNA methylation. Meanwhile, in neural progenitor cells, we study the effect of gene interactions and the silencing of MBD5 gene (Methyl-CpG Binding Domain Protein 5), which is important for brain development and possibly related to DNA methylation. For the first study, patients with antipsychotic-naïve FEP patients and healthy controls underwent clinical assessment and collection of peripheral blood. Patients were reevaluated with the same tests after two months of risperidone treatment, and part of them were also reassessed after one year, at those moments blood was also collected. DNA and RNA were extracted from blood. Gene expression was assessed by real-time PCR, and methylation analysis by sequencing after sodium bisulfite conversion. For the functional studies, the silencing of MBD5 gene was performed in neural progenitor cells, which underwent RNA sequencing, real-time PCR, Western blotting and flow cytometry. The results indicated that GCH1 (GTP cyclohydrolase 1) was downregulated and NDEL1 (nude neurodevelopment protein 1-like 1) and MBP (myelin basic protein) were upregulated in the blood of FEP patients compared to healthy controls. Comparing the patients before and after treatment, GABRR2 gene (gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, rho 2) was shown to be downregulated after risperidone treatment. In addition, GCH1 seems to be regulated by DNA methylation. As for the functional study, we found that MBD5 knockdown led to an imbalance between proliferation and differentiation of neural progenitor cells. llThese data indicated three genes that may be involved in psychosis per se, and is related to the dopaminergic and serotoninergic pathways (GCH1), neurodevelopment (NDEL1) and myelination (MBP). Furthermore, GABRR2 gene, although it does not seem to be a direct target of risperidone, can be associated with response to treatment or disease progression, thus indicating the importance of the GABA pathway. These data may be further investigated to identify biological markers for both the psychosis and for schizophrenia treatment, helping in the early intervention and resulting in the reduction of the duration of untreated psychosis, which can result in a decreased morbidity and improved quality of life for patients. We also observed that the MBD5 knockdown, a gene involved in neurodevelopmental diseases, promotes a more differentiated state than proliferative of neural progenitor cells, a phenotype that seems to be presented in the knockdown of other genes involved in these diseases, and hence may be a convergent mechanism of neurodevelopmental disorders such as autism, intellectual disability and schizophrenia.
Descrição
Citação
OTA, Vanessa Kiyomi Arashiro. Análise de expressão gênica e metilação de DNA de pacientes em primeiro episódio psicótico virgens de tratamento. 2015. Tese (Doutorado em Biologia Estrutural e Funcional) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2015.