Reprogramação epigenética das células germinativas primordiais de rato
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Data
2014-10-29
Autores
Cantao, Isabelle Hernandez [UNIFESP]
Orientadores
Teixeira, Taiza Stumpp Teixeira [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Introduction: Primordial germ cells (PGC) are the precursors of the gametes. During its development, PGC undergo epigenetic reprogramming when bulk demethylation occurs and they acquire characteristics of pluripotency. During this phase of their development, PCG are able to derive stable lineages of pluripotent cells (CGE) in vitro. In mice, CGE can be derived between 8.5dpc and 11.5dpc, but not at 12.5dpc, when SSEA1 is not detected and when epigenetic reprogramming is ending. In rats, PGC epigenetic reprogramming and the loss of SSEA1 occur earlier than in mice. Coincidently, it has not been possible so far to derive CGE from rat embryos at the corresponding ages, what lead us to suggest that this might be due to the precocious epigenetic reprogramming in rats in relation to mice. Objective: to establish a protocol to induce PGC-specific DNA demethylation in rats to mimic the in vivo demethylation that occurs during epigenetic reprogramming. With this, we intend to establish the first part for a methodology to derive CGE from older rat embryos, when more PGC are present. In addition this protocol may be helpful in studies about the epigenetic mechanisms involved in PGC reprogramming. Methods: The gonads of 14dpc, 15dpc and 20dpc embryos were immunolabelled for DNMT1, DNMT3a and DNMT3b, which establish and maintain DNA methylation and are the target for 5-Aza-CdR, a DNA demethylating agent. Embryo gonads at 16dpc were collected and incubated in vitro with or without 5-Aza-CdR for five days or directly analysed (control gonads). Histopathological analysis and 5mC, 5hmC and SSEA1 labelling were performed. The expression of fucosyltransferase 4 (Fut4) and fucosyltransferase 9 (Fut9), which are responsible for SSEA1 synthesis, was also analysed. Results: DNMT1, 3a and 3b are present on rat PGC and their expression is dependent on PGC differentiation stage. 5mC was absent in PGC from the gonads incubated with 5-Aza-CdR, but was present in the somatic cells, suggesting that the protocol used here induced the specific demethylation of PGC DNA. The expression of Fut4 and Fut9 was not detected in the control gonads, but was detected in the gonads incubated without 5-Aza-CdR. However, SSEA1 was not back in these gonads. This suggests that Fut4 and Fut9 may play another role besides SSEA1 synthesis. Conclusion: the data obtained here are important for future studies intending the derivation of rat CGE and may serve as a model for investigations about rat PGC reprogramming.
Introdução: As células germinativas primordiais (CGP) são as precursoras dos gametas. Durante curto período do seu desenvolvimento, as CGP passam por um processo de reprogramação epigenética, quando seu DNA sofre desmetilação global e elas adquirem características de pluripotência. Durante esta fase, elas são capazes de derivar células tronco pluripotentes in vitro (CGE). Em camundongos, esta capacidade é alta entre 8,5dpc e 11dpc, mas é praticamente nula aos 12,5dpc, quando não é mais observada expressão de SSEA1 e quando a reprogramação epigenética está terminando. Em ratos, a perda do antígeno SSEA1 e a reprogramação epigenética nas CGP ocorrem mais cedo do que em camundongo. Coincidentemente, não foi possível gerar CGE em idades correspondentes àquelas permissivas em camundongo. Levantou-se, então, a hipótese de que esta dificuldade se deve a diferenças no período de reprogramação epigenética das CGP entre essas duas espécies. Objetivo: estabelecer um protocolo para indução de desmetilação do DNA das CGP de rato visando mimetizar o período em que as CGP estão desmetiladas e estabelecer parte inicial de metodologia para obtenção futura de CGE em idades embrionárias avançadas. Além disso, este protocolo pode ser útil para estudos sobre os mecanismos envolvidos na reprogramação epigenética das CGP. Métodos: gônadas de embriões com 14, 15 e 20 dias pós-coito (dpc) foram submetidas à marcação imuno-histoquímica para DNMT1, DNMT3a e DNMT3b, que são responsáveis pela metilação do DNA e alvo da 5-Aza-CdR, agente usado para indução de desmetilação de DNA. Gônadas de embriões com 16dpc foram coletadas e submetidas ou não (controle-cultura) ao tratamento com 5-Aza-CdR in vitro por 5 dias para posterior análise histopatológica e investigação da presença de 5mC, 5hmC e SSEA1. A expressão das enzimas fucosiltransferase 4 (Fut4) e fucosiltransferase 9 (Fut9), responsáveis pela síntese de SSEA1, também foi avaliada. Como controles absolutos, as gônadas foram coletadas e analisadas diretamente. Resultados: As enzimas DNMT1, 3a e 3b estão presentes nas CGP de rato e sua expressão é dependente da fase de diferenciação dessas células. O tratamento com a dose de 1μM de 5-Aza-CdR levou à ausência de 5mC nas CGP mas não nas células somáticas, indicando que o protocolo de tratamento estabelecido foi capaz de induzir a desmetilação do DNA das CGP de rato de forma específica. A expressão das enzimas Fut4 e Fut9 estava ausente nas gônadas controle absoluto, mas foi detectada nas gônadas controle-cultura incubadas por 5 dias. Porém, o antígeno SSEA1 não voltou a estar presente nas CGP de rato, sugerindo que Fut4 e Fut9 exercem outra função além da síntese de SSEA1. Conclusões: os dados obtidos neste estudo são fundamentais para permitir a realização de experimentos futuros visando a obtenção de células tronco in vitro a partir das CGP de embrião de rato em idades mais avançadas. O protocolo aqui desenvolvido pode também servir de modelo para estudos sobre a reprogramação epigenética de células germinativas primordiais de rato.
Introdução: As células germinativas primordiais (CGP) são as precursoras dos gametas. Durante curto período do seu desenvolvimento, as CGP passam por um processo de reprogramação epigenética, quando seu DNA sofre desmetilação global e elas adquirem características de pluripotência. Durante esta fase, elas são capazes de derivar células tronco pluripotentes in vitro (CGE). Em camundongos, esta capacidade é alta entre 8,5dpc e 11dpc, mas é praticamente nula aos 12,5dpc, quando não é mais observada expressão de SSEA1 e quando a reprogramação epigenética está terminando. Em ratos, a perda do antígeno SSEA1 e a reprogramação epigenética nas CGP ocorrem mais cedo do que em camundongo. Coincidentemente, não foi possível gerar CGE em idades correspondentes àquelas permissivas em camundongo. Levantou-se, então, a hipótese de que esta dificuldade se deve a diferenças no período de reprogramação epigenética das CGP entre essas duas espécies. Objetivo: estabelecer um protocolo para indução de desmetilação do DNA das CGP de rato visando mimetizar o período em que as CGP estão desmetiladas e estabelecer parte inicial de metodologia para obtenção futura de CGE em idades embrionárias avançadas. Além disso, este protocolo pode ser útil para estudos sobre os mecanismos envolvidos na reprogramação epigenética das CGP. Métodos: gônadas de embriões com 14, 15 e 20 dias pós-coito (dpc) foram submetidas à marcação imuno-histoquímica para DNMT1, DNMT3a e DNMT3b, que são responsáveis pela metilação do DNA e alvo da 5-Aza-CdR, agente usado para indução de desmetilação de DNA. Gônadas de embriões com 16dpc foram coletadas e submetidas ou não (controle-cultura) ao tratamento com 5-Aza-CdR in vitro por 5 dias para posterior análise histopatológica e investigação da presença de 5mC, 5hmC e SSEA1. A expressão das enzimas fucosiltransferase 4 (Fut4) e fucosiltransferase 9 (Fut9), responsáveis pela síntese de SSEA1, também foi avaliada. Como controles absolutos, as gônadas foram coletadas e analisadas diretamente. Resultados: As enzimas DNMT1, 3a e 3b estão presentes nas CGP de rato e sua expressão é dependente da fase de diferenciação dessas células. O tratamento com a dose de 1μM de 5-Aza-CdR levou à ausência de 5mC nas CGP mas não nas células somáticas, indicando que o protocolo de tratamento estabelecido foi capaz de induzir a desmetilação do DNA das CGP de rato de forma específica. A expressão das enzimas Fut4 e Fut9 estava ausente nas gônadas controle absoluto, mas foi detectada nas gônadas controle-cultura incubadas por 5 dias. Porém, o antígeno SSEA1 não voltou a estar presente nas CGP de rato, sugerindo que Fut4 e Fut9 exercem outra função além da síntese de SSEA1. Conclusões: os dados obtidos neste estudo são fundamentais para permitir a realização de experimentos futuros visando a obtenção de células tronco in vitro a partir das CGP de embrião de rato em idades mais avançadas. O protocolo aqui desenvolvido pode também servir de modelo para estudos sobre a reprogramação epigenética de células germinativas primordiais de rato.
Descrição
Citação
CANTAO, Isabelle Hernandez. Reprogramação epigenética das células germinativas primordiais de rato. 2014. 75 f. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2014.