Estudo da expressão do receptor p2x7 e da síntese de óxido nítrico em célula mesangial imortalizada de camundongo em meio com alta glicose

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Data
2016-06-30
Autores
Fernandes, Thamires de Oliveira [UNIFESP]
Orientadores
Higa, Elisa Mieko Suemitsu Higa [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Diabetes mellitus (DM) is a non-transmissible chronic disease characterized by hyperglycemia, that injured many tissues as endothelium, leading to vascular disease and diabetic nephropathy (DN). Glomerular mesangial cells (MCs) are a source of nitric oxide (NO) production and plays important role in DN progression. The MCs have several receptors; among them, there are the purinergics. In our laboratory, we showed that P2X7, a purinergic receptor, was highly expressed in DM; however when the oxidative stress was controlled, the renal NO was recovered and the activation of this receptor was significantly reduced. The aim of the present study was to evaluate the P2X7 receptor expression and nitric oxide synthesis in immortalized mouse mesangial cells under high glucose conditions. MCs were cultured in DMEM with 5% fetal bovine serum and were maintained in plates placed in incubator at 37ºC, 5% CO2. At 50% of confluence, the MCs were cultured in media with normal glucose (NG ? 5mmol/L), high glucose (HG - 30mmol/L) or mannitol (MA - 30mmol/L) for 72hr. After this time, the cell viability was assessed by an automated counter. The supernatant was collected to NO quantification (?mol/mg protein) and protein was analyzed by Western blot for evaluation of caspase-3, inducible and endothelial nitric oxide synthase (iNOS and eNOS) and P2X7. The cell viability remained close to 95% in all groups, showing no statistical difference. The NO levels were increased in HG group (134 ±18) when compared to MA (62 ±17) and NG (62 ±16) groups (all with p<0.05). The HG group also showed increase in the iNOS, caspase-3 and P2X7 expression (0.38 ± 0.02; 0.68 ± 0.04; 1.26 ± 0.07; XVIII respectively) when compared to MA (0.19 ± 0.01; 0.41 ± 0.01; 0.90 ± 0.05; respectively) and NG groups (0.22 ± 0.02; 0.45 ± 0.02; 0.87 ± 0.05; respectively) (all with p<0.05). The eNOS was not significantly different between the groups. P2X7 showed strong (r=0.8) and significant (p<0.0001) positive correlation with NO. Therefore, in this study we observed that HG increased the proliferation and apoptosis. Furthermore, there was a significant increase in the NO levels and that probably occurred via increased iNOS and P2X7. In high glucose, the levels of extracellular ATP are increased, contributing to increase the P2X7 receptors expression; these, in turn, are responsible for releasing pro inflammatory cytokines that stimulate the increase of iNOS expression and, consequently the NO synthesis. In conclusion, we observed that in CMiC in high glucose conditions, the P2X7 expression and NO synthesis were increased, with strong positive correlation between them. We suggest that these receptors trigger deleterious effects on renal tissue, and therefore, could be an important therapeutic target in the treatment and/or in delaying the diabetic renal complications.
Diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica não-transmissível caracterizada por hiperglicemia; esta danifica diversos tecidos como o endotélio, levando à doença vascular e nefropatia diabética (ND). As células mesangiais (CM) presentes nos glomérulos são uma fonte de óxido nítrico (NO) e desenvolvem um papel importante na progressão da ND. CMs possuem diversos receptores, entre eles encontramos os receptores purinérgicos. Em nosso laboratório demonstramos que o receptor P2X7 estava altamente expresso no DM, entretanto quando o estresse oxidativo foi controlado, houve a recuperação do NO renal e os níveis de ativação desse receptor estavam significantemente reduzidos. E por esse motivo, objetivou-se estudar a expressão do receptor P2X7 e a síntese de NO em cultura de célula mesangial imortalizada de camundongo (CMiC), cultivada em meio com glicose alta. CMiC foram cultivadas em meio de cultura - DMEM, suplementado com 5% de soro bovino fetal e mantidas em placas alojadas em incubadora a 37ºC com 5% de CO2. Após atingirem 50% de confluência, as células foram cultivadas em meio com concentração normal de glicose (NG ? 5mmol/L); glicose alta (HG ? 30mmol/L) ou manitol (MA -30mmol/L) por 72 horas. Após esse período, a viabilidade celular foi avaliada por um contador automatizado; o sobrenadante foi coletado para quantificação direta do NO (?mol/mg proteina) e a proteína foi analisada por Western blot para verificação da expressão das isoformas endotelial e induzível da NOS (eNOS e iNOS), caspase-3 e P2X7. A viabilidade celular manteve-se próxima dos 95% em todos os grupos, sem demonstrar diferença;contudo, houve significante aumento da proliferação celular no grupo HG quando comparado com os demais grupos. Os níveis de NO estavam aumentados no grupo HG (134 ±18) quando comparado com os grupos MA (62 ±17) e NG (62 ±16), todos com p<0,05. O grupo HG também demonstrou aumento na expressão de iNOS, caspase-3 e P2X7 (0,38 ± 0,02; 0,68 ± 0,04; 1,26 ± 0,07; respectivamente) quando comparado com os grupos MA (0,19 ± 0,01; 0,41 ± 0,01; 0,90 ± 0,05; respectivamente) e NG (0,22 ± 0,02; 0,45 ± 0,02; 0,87 ± 0,05; respectivamente), todos com p<0,05; eNOS não apresentou diferença entre os grupos. P2X7 apresentou forte (r=0,8) e significante (p<0,0001) correlação positiva com o NO. Portanto, no nosso estudo observamos que glicose alta aumentou a proliferação, juntamente com a morte celular via apoptose; verificou-se ainda que houve aumento significante nos níveis de NO e que isso provavelmente ocorreu via iNOS e P2X7. Em meio com alta concentração de glicose, os níveis de adenosina trifosfato (ATP) extracelular estão elevados, contribuindo para o aumento da expressão dos receptores P2X7; estes por sua vez, são responsáveis por liberar citocinas pró-inflamatórias que estimulam o aumento da expressão da iNOS e consequentemente a síntese de NO. Em conclusão, vimos que em CMiC em meio com glicose alta a expressão do P2X7 e a síntese de NO estavam aumentadas, com forte correlação positiva entre si. Sugerimos que tais receptores desencadeiam efeitos deletérios no tecido renal e portanto, poderiam ser importante alvo terapêutico no tratamento e/ou prevenção das complicações microvasculares renais do DM.
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Citação
FERNANDES, Thamires de Oliveira. Estudo da expressão do receptor p2x7 e da síntese de óxido nítrico em célula mesangial imortalizada de camundongo em meio com alta glicose. 2016. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.