Análise molecular do plasma seminal de pacientes com lesão medular, baseada em espectrometria de massas: proteômica quantitativa e fosfoproteômica

Abstract

Objective: This study aims the molecular characterization of seminal plasma obtained from spinal cord injured (SCI) patients. Method: Seminal plasma samples were collected from 12 SCI patients through penile vibrtoru stimulation (PVS) and 11 control donors uninjured and normozoospermic. The protein concentration of each sample was estimated with the Bradford assay. All samples from control subjects were grouped forming a pool of proteins (1 mg total). SCI samples were either grouped in a representative pool containing 1 mg of total protein (10 samples) or individually analyzed (12 samples, 1mg / sample). The samples were subjected to sequential digestion combining the endoproteinase Lys-C with trypsin and the resulting peptides were chemically labeled with stable isotopes according to group, ?light" for SCI samples (individual and pooled) and "intermediate" to control samples. The main differences between groups were assessed by comparing pooled samples ("pool experiment?), wheras specific variations among individuals were investigated analyzing individual samples ("individual experiment") Thus, the labeled peptides were grouped in a 1: 1 ratio (pool control: LM pool, pool control: individual sample) and the final mixture subjected to off-line fractionation in a hSAX column. A total of 48 fractions were collected for the "pool experiment" and 36 fractions (combined into final 30 fractions) for "individual experiment." All collected fractions were finally analyzed by LC-MS/ MS in a LTQ Orbitrap Elite-("pool experiment") or in a LTQ Orbitrap XL ("individual experiment"). For the analysis of phosphoproteome, pooled and differentially labeled samples were initially mixed, digested to peptides and loaded into a Fe-IMAC column coupled to an HPLC system for the enrichment of phosphopeptides. The chromatogram was monitored and the peak of interest containing the phosphopeptides was collected. Then for fractionation of the sample, C18 micro columns material prepared in pipette tips (stage-tip column) were used. Four fractions were obtained and analyzed by LC-MS / MS on an LTQ-Orbitrap Velos. Results: For the experiment of quantitative proteomics, we present a deep characterization of the proteome of human seminal plasma, identifying over 2,800 unique proteins, and describe in detail the differential proteome observed in SCI patients. Our analysis shows that a hyperactivation of the immune system is not triggered by microbial infection and can influence some seminal processes. In addition, we found an important prostatic functional failure and identify the main outcome related to this fact, which is intrinsically linked to low sperm motility observed in SCI patients: decrease of metabolic enzymes, related to the production of ATP, secreted via prostasomos. Together, our results suggest that the molecular prevent fertility in patients LM and launches new perspective on other causes of male infertility. Regarding the phosphoproteome experiment, 33 different phosphoproteins were identified, corresponding to 428 phosphopeptides. Our results showed nearly 116 different phosphorylation sites, with a minimum of two peptides and 1% FDR. Through quantitative comparison between patients and SCI contols, we observed the existence of differential phosphorylation patterns. Thus, a total of 14 individual phosphoproteins were more abundant in the SCI group, whereas 9 phosphoproteins were less abuandant in the control group. A total of 53 phosphorylation sites in the SCI group and a total of 40 phosphorylation sites in the control group were identified. However, our most significant results were observed in relation to semenogelinas. Were identified with confidence, 29 new phosphorylation sites in semenogelinas (sites 14 and 15 as described for SEMG1 sites described for SEMG2). To SEMG1, about 7 phosphorylation sites found to be elevated in the SCI group. Six different phosphorylation sites were found iless abundant in the SCI group. For SEMG2 about 5 phosphorylation sites were found more abundant in SCI group, while 10 phosphorylation sites were observed to be less abundant in this group. These results raise the possibility that, as the prostate, seminal vesicles LM patients may have functional abnormalities and engaging in poor semen quality by these patients. Conclusions: This study described infertility related to SCI, in a proteomic level, highlighting the main factors that can compromise the functionality of sperm cells, mainly the motility. Our results show that the LM patients have strong activity of the immune system, which is not driven by a microbial infection. We also found a striking induction of proteinase inhibitors, and a simultaneous loss of proteases. Moreover, our results show that the loss of function of the prostate is primarily responsible for causing the molecular and macroscopic phenotype observed in infertility due to SCI. In addition, this study describes for the first time, the human seminal plasma phosphoproteome, showing that quantitative differences between groups may exist, indeed. The study of different patterns of phosphorylation may also facilitate the understanding of the mechanisms that lead to infertility due to SCI. The study of phosphorylation provides an additional level of information to the proteomic data, highlighting the main factors that can compromise the functionality of sperm mainly cell motility. Our results show that the LM patients have many phosphoproteins related to the seminal vesicles. Perhaps the standard differential phosphorylation is related to glandular malfunction resulting from LM own.

Objetivo: Este trabalho visa à caracterização molecular do plasma seminal obtido de pacientes com anejaculação causada por lesão medular (LM). Método: Amostras de plasma seminal foram coletadas, de 12 pacientes LM por estimulação vibratória peniana (EVP) e 11 doadores controle não lesionados e normozoospérmicos. A concentração de proteína de cada amostra foi estimada através do método de Bradford. Todas as amostras de indivíduos controle foram agrupadas formando um pool de proteínas (1mg total) representativo do grupo. As amostras LM ou foram agrupadas em pool representativo contendo 1mg de proteínas totais (10 amostras) ou analisadas individualmente (12 amostras, 1mg/amostra). Todas as amostras foram submetidas a uma digestão sequencial de proteínas combinando endoproteinase Lys-C com tripsina e os peptídeos resultantes foram quimicamente marcados por reação de dimetilação com isótopos estáveis, de acordo com o grupo. As principais diferenças entre os grupos foram acessadas através da comparação de pool de amostras ("experimento pool?), à medida que variações específicas entre indivíduos foram investigados através da análise de amostras individuaís ("experimento individual?). Assim, os peptídios marcados foram agrupados em proporção 1:1 (pool controle:pool LM; pool controle:amostra individual) e a mistura final submetida a fracionamento off-line. Um total de 48 frações foram coletadas para a "experimento pool" e 36 frações (combinadas em 30 frações) para o "experimento individual." Todas as frações coletadas foram finalmente analisadas por espectrometria de massas (MS) em tandem (MS/MS). Para análise de fosfoproteômica, as amostras diferencialmente marcadas por reação de dimetilação foram inicialmente misturadas, digeridas a peptídeos e aplicadas em uma coluna de Fe-IMAC acoplada a um sistema de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) para o enriquecimento dos fosfopeptídeos. Em seguida, a amostra foi fracionada e posteriormente analisada por MS/MS. Resultados: Em relação ao experimento de proteômica quantitativa, obteve-se uma ampla caracterização do proteoma do plasma seminal humano, identificando-se mais de 2.800 proteínas únicas, além de descrever, em detalhes, o proteoma diferencial observado em pacientes LM. A análise funcional do proteoma demonstrou que uma hiper-ativação do sistema imunológico, a qual não é desencadeada por infecção microbiana, pode influenciar em alguns processos seminais importantes. Além disso, os resultados apontam em direção a uma relevante falha funcional prostática, intrinsecamente relacionada à baixa motilidade dos espermatozoides, observada em pacientes LM. À baixa funcionalidade prostática está ligagada a diminuição de enzimas metabólicas, responsáveis pela produção de ATP extracelular, secretadas via prostasomos. Em relação ao experimento de fosfoproteômica, no total 33 diferentes fosfoproteínas foram identificadas, correspondendo a 428 fosfopeptídeos. Ao todo, cerca de 116 diferentes sítios de fosforilação, com um mínimo de 2 peptídeos e 1% FDR foram identificados. Através da comparação quantitativa entre pacientes LM e contoles, foi possível observar que um total de 14 fosfoproteínas individuais apresentou-se elevado no grupo LM, ao passo que 9 fosfoproteínas apresentaram-se diminuídas no memso grupo. Um total de 53 sítios de fosforilação no grupo LM e um total de 40 sítios de fosforilação no grupo controle foram identificados. Entretanto, os resultados mais expressivos foram observados em relação à semenogelinas. Foram identificados, com confiança, 29 novos sítios de fosforilação em semenogelinas (14 sítios descritos para SEMG1 e 15 sítios descritos para SEMG2). Para SEMG1, cerca de 7 sítios de fosforilação encontraram-se elevados no grupo LM. Não obstante, 6 diferentes sítios de fosforilação encontraram-se diminuídos no grupo LM . Para SEMG2, cerca de 5 sítios de fosforilação foram encontrados elevados no grupo LM, ao passo que 10 sítios de fosforilação encontraram-se diminuídos nesse grupo. Tais resultados levantam a hipótese de que, assim como a próstata, as vesículas seminais de pacientes LM podem apresentar anormalidades funcionais e estarem envolvidas na baixa qualidade seminal apresentada por esses pacientes. Conclusões: Este estudo descreveu a infertilidade relacionada à LM, em um nível proteômico, evidenciando os principais fatores que podem comprometer a funcionalidade dos espermatozoides, principalmente, a motilidade celular. Cerca de 2.800 proteínas foram identificadas com alta confiança, evidenciando que pacientes LM apresentam forte atividade do sistema imunológico, não acionado por infecção microbiana. Há, também, uma indução de inibidores de proteases e uma perda simultânea de proteases. No entanto, a possível perda de função da próstata talvez seja o principal responsável por causar o fenótipo molecular e macroscópico, observado na infertilidade decorrente de LM. Além disso, este estudo descreveu o fosfoproteoma do plasma seminal humano, em detalhe. O estudo de diferentes padrões de fosforilação pode, também, facilitar a compreensão dos mecanismos que levam à infertilidade decorrente de LM. Os resultados evidenciaram que pacientes LM apresentam muitas fosfoproteínas relacionadas às vesículas seminais. Talvez o padrão de fosforilaç?o diferencial esteja relacionado a problemas de funcionamento glandulares decorrentes da propria LM.