Estudo funcional e estrutural de inibidores de proteases tipo cistatina identificados em intestino do carrapato rhipicephalus (boophilus) microplus
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Data
2016-03-31
Autores
Cardoso, Thyago Hermylly Santana [UNIFESP]
Orientadores
Tanaka, Aparecida Sadae Tanaka [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
Título da Revista
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Resumo
Ticks are important vectors of diseases to humans and other vertebrates. The Rhipicephalus (Boophilus) microplus is an ectoparasite of catt1e exclusive1y, responsib1e for the transmission of infections caused by Ricketsia sp, Anaplasma sp, Babesia sp. R. microplus is responsib1e for great damage to livestock due to considerab1e losses in the production of meat, milk and 1eather. In Brazil this Ioss reached two billion dollars. Some proteins such as enzymes and protease inhibitors have been identified and characterized in saliva, but 1ittle is known about the proteins identified in the gut of the tick. Recent1y, a gut transcriptome of R. microplus was performed in our 1aboratory, among the genes found an inhibitor of cysteine proteases of the cystatin family had been identified. In this work, the inhibitor was named Rrncystatin-4 and evaluated its gene expression in different tissues of the tick, where it was possible to determine its specific location in the midgut. The gene Rrncystatin-4 presents an open reading frame of 390 bp, encoding 129 amino acids, m~1~cu1ar mass and theoretical isoelectric point of 14.2 kDa and 6.87, respective1y. Rrncystatin-4 show four cysteine residues thought to be responsib1e for two disulfide bonds, a signal peptide and conserved motifs predicted for cystatins (G), (QxVxG) and (PW). Recombinant Rrncystatin-4 was expressed in yeast, the purified protein showed inhibition for the following papain, followed by BmCl-l, cathepsin B and cathepsin L with Ki va1ues of 4,08 nM; 9,93 nM; 92,8 nM e 897 nM respectively. The Rrncystatin-4 inhibited BmCL-l, suggesting that could be physiologica1 controller of this enzyme because both are co-located in the tick midgut. This work was also subcloned Bmcistatina-l inhibitor (Lima et al 2006) and the recombinant protein was used for crystallization experiments in which microcrystals were obtained, but they were small to be diffrated.
Os carrapatos são importantes vetores de doenças para o homem e outros animais vertebrados. O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito exclusivo de bovinos, sendo responsável pela transmissão de infecções causadas por ricketsia, Anaplasma sp, Babesia sp. O R. microplus causa grandes prejuízos à pecuária devido a perdas consideráveis na produção de carne, couro e leite. No Brasil esse prejuízo alcançam dois bilhões de dólares. Algumas proteínas como, por exemplo, enzimas e inibidores proteicos já foram identificados e caracterizados na saliva, entretanto pouco se sabe a respeito das proteínas identificadas no intestino do carrapato. Recentemente, foi realizado um transcriptoma de intestino de R. microplus no nosso laboratório, dentre os genes encontrados foi identificado um inibidor de cisteínoproteases da família das cistatinas. Neste trabalho, o inibidor foi nomeado Rmcistatina-4 e sua expressão gênica avaliada em diferentes tecidos do carrapato, onde foi possível determinar sua localização específica no intestino. O gene de Rmcistatina-4 apresenta uma fase de leitura aberta de 390 pares de bases, que codificam 129 aminoácidos, massa molecular e ponto isoelétrico teóricos de 14,2 kDa e 6,87, respectivamente. Rmcistatina-4 apresentam quatro resíduos de cisteína provavelmente responsáveis por duas pontes dissulfeto, um peptídeo sinal e os motivos conservados de cistatinas preditos (G), (QxVxG) e (P\V) A Rmcistatina-4 recombinante foi expressa em levedura, a proteína purificada apresentou inibição para as seguintes, papaína, seguida de BmCl-l, catepsina B e catepsina L com valores de Ki = 4,08 nM; 9,93 nM; 92,8 nM e 897 nM, respectivamente. O inibidor Rmcistatina-4 inibiu a enzima BmCL-l, sugerindo ser um dos controladores fisiológico desta enzima, pois ambos estão co-localizados no intestino do carrapato. Neste trabalho, também foi sub-clonado o inibidor Bmcistatina-I (Lima et ai 2006) e a proteína recombinante foi utilizada para a realização dos experimentos de cristalização, nos quais foram obtidos micro cristais, no entanto os mesmos não foram
Os carrapatos são importantes vetores de doenças para o homem e outros animais vertebrados. O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito exclusivo de bovinos, sendo responsável pela transmissão de infecções causadas por ricketsia, Anaplasma sp, Babesia sp. O R. microplus causa grandes prejuízos à pecuária devido a perdas consideráveis na produção de carne, couro e leite. No Brasil esse prejuízo alcançam dois bilhões de dólares. Algumas proteínas como, por exemplo, enzimas e inibidores proteicos já foram identificados e caracterizados na saliva, entretanto pouco se sabe a respeito das proteínas identificadas no intestino do carrapato. Recentemente, foi realizado um transcriptoma de intestino de R. microplus no nosso laboratório, dentre os genes encontrados foi identificado um inibidor de cisteínoproteases da família das cistatinas. Neste trabalho, o inibidor foi nomeado Rmcistatina-4 e sua expressão gênica avaliada em diferentes tecidos do carrapato, onde foi possível determinar sua localização específica no intestino. O gene de Rmcistatina-4 apresenta uma fase de leitura aberta de 390 pares de bases, que codificam 129 aminoácidos, massa molecular e ponto isoelétrico teóricos de 14,2 kDa e 6,87, respectivamente. Rmcistatina-4 apresentam quatro resíduos de cisteína provavelmente responsáveis por duas pontes dissulfeto, um peptídeo sinal e os motivos conservados de cistatinas preditos (G), (QxVxG) e (P\V) A Rmcistatina-4 recombinante foi expressa em levedura, a proteína purificada apresentou inibição para as seguintes, papaína, seguida de BmCl-l, catepsina B e catepsina L com valores de Ki = 4,08 nM; 9,93 nM; 92,8 nM e 897 nM, respectivamente. O inibidor Rmcistatina-4 inibiu a enzima BmCL-l, sugerindo ser um dos controladores fisiológico desta enzima, pois ambos estão co-localizados no intestino do carrapato. Neste trabalho, também foi sub-clonado o inibidor Bmcistatina-I (Lima et ai 2006) e a proteína recombinante foi utilizada para a realização dos experimentos de cristalização, nos quais foram obtidos micro cristais, no entanto os mesmos não foram
Descrição
Citação
CARDOSO, Thyago Hermylly Santana. Estudo funcional e estrutural de inibidores de proteases tipo cistatina identificados em intestino do carrapato rhipicephalus (boophilus) microplus. 2016. 80 f. Tese (Doutorado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.