Investigação da prevalência de mutações e fusões de genes que codificam efetores da via mapk e sua correlação com características clinico-patológicas e perfil de expressão em carcinomas papilíferos da tiroide

Abstract

Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most prevalent subtype among thyroid carcinomas, representing about 80% of cases. Its prevalence has increased in recent years, mainly due to the increase of papillary thyroid microcarcinomas (PTC ?10 mm, PTMC). In recent decades, it became clear that genetic changes that lead to activation of the MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase pathway), a signaling cascade that regulates cell proliferation, differentiation and survival, are highly prevalent in PTC. Alterations in the genes encoding proteins of this pathway represent a total of approximately 70% of cases of PTC, and include chromosomal rearrangements like RET/PTC or NTRK, and mutations in RAS and BRAF genes. In addition to these changes, new fusions involving tyrosine kinases have been described recently by The Cancer Genome Atlas (TCGA). However, in a number of cases of PTCs, a genetic event associated with pathogenesis (driver changes) is still unknown ("dark-matter"). In order to describe the genetic events associated with pathogenesis of PTC in the Brazilian population, our group investigated the prevalence of BRAF V600E mutation in a sample set of 120 PTCs. In addition to determining the prevalence of this mutation (48%; n=58), we observed the association with histological subtype, clinical and pathological features associated with a poor prognosis, and loss of expression of genes involved in iodine uptake and metabolism (NIS and TSHR). These data associated with the reported in the literature suggest that BRAF V600E is a marker of poor prognosis. In the articles that originate this thesis, we initially investigated the prevalence of RET/PTC, which is the second most frequent genetic alteration in the PTC, and we evaluated the expression of TPO, PDS and TG. Fusions involving the RET gene (RET/PTC1, RET/PTC2 and RET/PTC3) were identified in 27% (32/118) of PTCs. There was no association between RET/PTC, expression of genes associated with iodine uptake and metabolism and clinic-pathologic characteristics associated with aggressiveness. In fact, the role of RET/PTC as a prognostic marker is still controversial. Besides NIS, previously reported, in this study we demonstrate that BRAF V600E mutation is also associated with the loss of TPO expression. Additionally, we identified the mutation in codon 61 of NRAS in 9% (11/118) of PTCs. When we evaluate the genetic changes in PTMC (n=40), we found no association with clinic-pathologic characteristics associated with aggressiveness, but we found that the BRAF V600E mutation is associated with a decreased expression of NIS and TPO. When PTMCs were divided into two subgroups (<7 mm vs. ?7 mm) we observed that MCPTs ?7 mm have higher extrathyroidal extension, metastasis to lymph nodes and recurrence rates, and that the decreased expression of NIS and TPO is much more evident in this group. This is probably due to the accumulation of PTMCs with BRAFV600E in the ?7 mm subgroup. These data are similar to those found in tumors larger than 10 mm, more aggressive, which suggests that despite PTMCs being, most often, clinically indolent, the subgroup of 7-10 mm with BRAF V600E could be treated in a similar manner to conventional PTC with BRAF V600E. In the second phase of this study, we investigated the presence of ETV6-NTRK3, STRN-ALK and AGK-BRAF fusion genes, recurring events in PTCs that are able to activate the MAPK pathway. We also investigated the presence of mutations in the KRAS and HRAS genes (codons 12, 13 and 61), and only one of the samples was positive for HRAS Q61R. ETV6-NTRK3 was identified in about 5% (6/116) of PTCs. ETV6- NTRK3 was exclusively found in the follicular variant of PTC (FVPTC), leading to a prevalence of 16% (6/45) in this variant. This fact is interesting, since most of the "dark-matter" is composed of PTCs of this variant. In addition, we investigate whether such mutation would have some association with the presence of the tumor capsule. ETV6-NTRK3 was found in both variants, infiltrative and encapsulated, in 50% each. As a recently new nomenclature was suggested for encapsulated FVPTC without any invasion, called noninvasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear characteristics (NIFTP), the relationship between ETV6-NTRK3 and NIFTP variant should be further investigated. STRN-ALK was identified in 3% (4/116) of PTC and was found in both classic and FVPTC. There was no association with clinic-pathological features associated with aggressiveness. We did not find any positive sample for AGK-BRAF in this series. This finding confirms the proposition that AGK-BRAF is a likely event associated with PTCs of pediatric patients. Finally, in this initial screening, we identified that 27% (n=30) of the samples were negative for BRAF V600E (and adjacent codons), NRAS Q61, HRAS (codons 12, 13 and 61), KRAS (codons 12, 13 and 61) RET/PTC1, RET/PTC2, RET/PTC3, ETV6-NTRK3, STRN-ALK and AGK-BRAF. Our data contribute to a better understanding of the pathogenesis of PTC and collects important data regarding the use of various alterations as prognostic markers. Along with other previously published articles, and articles that will be published in future in several other populations, we hope this information can help to establish effective guidelines for the management and treatment of patients with papillary carcinoma of the thyroid.

O carcinoma papilífero da tiroide (CPT) é o subtipo mais prevalente entre os carcinomas da tiroide, correspondendo a aproximadamente 80% dos casos. A sua prevalência tem aumentado nos últimos anos, principalmente devido ao aumento de microcarcinomas papilíferos da tiroide (CPT ?10 mm, MCPT). Nas últimas décadas, ficou evidente que alterações genéticas que levam a ativação da via MAPK (do inglês, Mitogen-Activated Protein Kinase), uma cascata de sinalização que regula proliferação, diferenciação e sobrevivência celular, são altamente prevalentes em CPT. Alterações nos genes que codificam para proteínas desta via perfazem um total de aproximadamente 70% dos casos de CPT e incluem rearranjos cromossômicos do tipo RET/PTC ou NTRK, e mutações nos genes RAS ou BRAF. Além destas alterações, novas fusões envolvendo tirosinas quinases foram descritas recentemente pelo The Cancer Genome Atlas (TCGA). Contudo, em uma parcela dos casos de CPTs o evento genético associado a patogênese (alteração driver) ainda é desconhecido. Com o objetivo de caracterizar os eventos genéticos associados a patogênese do CPT na população brasileira, nosso grupo investigou a prevalência da mutação BRAF V600E em uma casuística de 120 CPTs. Além da determinação da prevalência dessa alteração (48%; n=58), observamos a associação com subtipo histológico, características clínico-patológicas associadas a agressividade e perda da expressão dos genes de captação e metabolismo do iodo (NIS e TSHR). Estes dados, associados aos reportados na literatura, sugerem que BRAF V600E é um marcador de pior prognóstico. Nos trabalhos que deram origem a esta tese, inicialmente investigamos a prevalência das fusões RET/PTC, que constituem a segunda alteração genética mais frequente no CPT, bem como avaliamos a expressão dos genes TPO, PDS e TG. Fusões envolvendo o gene RET (RET/PTC1, RET/PTC2 e RET/PTC3) foram identificadas em 27% (32/118) dos CPTs. Não houve associação entre RET/PTC, expressão dos genes associados a captação e metabolismo de iodo e características clínico-patológicas associadas a agressividade. De fato, o papel de RET/PTC como marcador de prognóstico ainda é controverso. Além de NIS, previamente reportado, neste estudo demonstramos que a mutação BRAF V600E também está associada com a perda da expressão de TPO. Ainda, identificamos a presença da mutação no códon 61 de NRAS em 9% (11/118) dos CPTs. Quando avaliamos as alterações genéticas nos MCPT (n=40), não encontramos nenhuma associação com características clínico-patológicas associadas à agressividade, porém verificamos que a mutação BRAF V600E encontra-se associada a uma expressão diminuída de NIS e TPO. Ainda, quando dividimos os MCPT em dois subgrupos (<7 mm vs ?7 mm) verificamos que os MCPTs ?7 mm, apresentam maiores taxas de extensão extra-tiroidiana, metástase para linfonodos e recorrências, e que a diminuição da expressão de NIS e TPO é muito mais evidente neste grupo. Isto é provavelmente devido ao acúmulo de MCPTs com BRAF V600E no subgrupo ?7 mm. Esses dados são similares aos encontrados em tumores maiores do que 10 mm, mais agressivos, o que sugere que, apesar de MCPTs serem, na maioria das vezes, clinicamente indolentes, o subgrupo de 7-10 mm com BRAF V600E poderia ser tratado de maneira semelhante aos CPT convencionais com BRAF V600E. Na segunda fase deste estudo, avaliamos a presença das fusões ETV6-NTRK3, STRN-ALK e AGK-BRAF, eventos recorrentes nos CPTs e que são capazes de ativar a via MAPK. Também investigamos a presença de mutação nos genes HRAS e KRAS (códons 12, 13 e 61), e apenas uma das amostras foi positiva para HRAS (Q61R). ETV6-NTRK3 foi identificado em 5% (6/116) dos CPTs. ETV6-NTRK3 foi encontrado exclusivamente na variante folicular do CPT (CPTVF), o que leva a uma prevalência de 16% (6/45) nesta variante. Este dado é interessante, visto que a maior parte da ?dark-matter? é composta por tumores desta variante. Além disso, investigamos inicialmente se essa alteração teria alguma associação com a presença de cápsula. ETV6-NTRK3 foi encontrado em ambas as variantes, encapsulada e infiltrativa, em 50% cada. Como foi recentemente sugerido uma nova nomenclatura para CPTVF encapsulados sem nenhum tipo de invasão, denominados neoplasia folicular não-invasiva com características nucleares papilíferas (NIFTP, do inglês Non- Invasive Follicular Thyroid neoplasia with Papillary-like nuclear features), a relação entre ETV6-NTRK3 e a variante NIFTP ainda precisa ser melhor investigada. STRN-ALK foi identificado em 3% (4/116) dos CPT, e foi encontrado tanto em CPT clássico como CPTVF. Não foi encontrada associação com características clinico-patológicas associadas a agressividade. Não encontramos nenhuma amostra positiva para AGK-BRAF nesta casuística. Este achado corrobora para a proposição de que AGK-BRAF é um evento provavelmente associado com CPTs de pacientes pediátricos. Este screening inicial permitiu identificar que 27% (n=30) das amostras foram negativas para BRAF V600E (e códons adjacentes), NRAS Q61, HRAS (códons 12, 13 e 61), KRAS (códons 12, 13 e 61), RET/PTC1, RET/PTC2, RET/PTC3, ETV6-NTRK3, STRN-ALK e AGK-BRAF. Nossos dados contribuem para o melhor entendimento da patogênese do CPT e reúne dados importantes para a utilização das variadas alterações como marcadores de prognóstico do CPT. Juntamente com outros artigos já publicados, e artigos que futuramente serão publicados realizados em várias outras populações, esperamos que estes dados possam contribuir para estabelecer diretrizes eficientes para o manejo e tratamento dos pacientes com carcinoma papilífero da tiroide.