Caracterização proteômica, peptidômica e transcriptômica dos venenos de aranhas do gênero acanthoscurria
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Data
2015-04-09
Autores
Abreu, Thiago Ferreira de [UNIFESP]
Orientadores
Tashima, Alexandre Keiji Tashima [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
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Resumo
Spiders are one of the most successful animals on the planet, currently recording 45,330 species divided into 3957 genus and separated in two suborders: Mesothelae and Opistothelae. The most studied spiders belong to the second suborder, which are organized in two groups based on chelicerae position (Araneomorph and Mygalomorphae) and are studied, among other reasons, because of their medical and biological relevance. The chelicerae inoculates a toxic secretion produced by the venom gland for subduying preys and protection against predators. The venom presents a range of components with specific functions and synergical effects. Recent studies of spider venoms demonstrated the presence of proteins and peptides with antimicrobial activity against fungi, bacteria and protozoa, ion channel modulation and selective activity against vertebrate and invertebrate receptors, indicating the biotechnological potential for these molecules. The study of the spider venom molecular arsenal is also relevant to the understanding of phylogeny and evolutionary success and to determine variations in composition, which may depend on individual variability, sexual dimorfism and diet. Nonetheless, there are few studies about these animals. In this study, considering the biotechnological potential and the biological relevance of the toxins in spider venoms, a quantitative proteomic study of venoms from male and female spiders belonging to Acanthoscurria gomesiana and Acanthoscurria juruenicola species was developed, besides transcriptomics of A. juruenicola venom glands, and antimicrobial assays of purified peptides. Transcriptomic analysis of female A. juruenicola venom glands resulted in 88,335 protein sequences obtained by translation of its respective cDNAs. Digestion of venoms with trypsin and thermolysin followed by mass spectrometry analysis by data-dependent acquisition (DDA) and data-independent acquisition (DIA) approaches resulted in the identification of 353 proteins in A. juruenicola venoms and 188 proteins in A. gomesiana venoms by automated de novo sequencing and database searches. Absolute quantification of proteins present in A. juruenicola spider venoms by DIA showed a prevalence of toxins, such as cysteine-rich venom protease (CRISPs), theraphotoxins, metalloendopeptidases, lipases, hyaluronidases, tyrosine-phosphatase and metallocarboxypeptidases. One of A. juruenicola theraphotoxins showed complete homology with the peptide already described from Acanthoscurria paulensis venom (U1-theraphotoxin-Ap1a) and a new theraphotoxin from A. gomesiana, Ag1a, was fully characterized. Crude venom fractionation by gel filtration chromatography in order to purify peptides (1-7 kDa) was accomplished, enabling the isolation and characterization of A. gomesiana and A. juruenicola theraphotoxins. Antimicrobial assays against a yeast (Candida albicans) and three bacteria, two Gram negatives (Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli) and one Gram positive (Micrococcus luteus) was accomplished with these peptides and the minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined.
As aranhas apresentam-se como um dos animais venenosos mais bem sucedidos no planeta, contando atualmente com 45.330 espécies dividas em 3957 gêneros e separados em duas subordens: Mesothelae e Opistothelae. As aranhas mais estudadas pertencem à segunda subordem, que é por sua vez dividida em dois grupos com base na posição das quelíceras (Araneomorphae e Mygalomorphae) e são estudadas, dentre outros fatores, por sua relevância médica e biológica. A quelícera é a responsável pela produção e inoculação de uma secreção tóxica produzida pela glândula de veneno, cujo propósito está em subjulgar presas e como proteção contra predadores. O veneno possui diversos componentes comfunções específiccas e atuação sinérgica. Estudos recentes dos venenos desses animais indicaram a presença de proteínas e peptídeos com atividade antimicrobiana contra fungos, bactérias e protozoários, atuação em canais iônicos e ação seletiva contra receptores característicos de vertebrados ou invertebrados, indicando o potencial biotecnológico dessas moléculas. O estudo do arsenal presente nos venenos das aranhas também é relevante para a elucidação da biologia destes animais, ora por facilitar o entendimento de sua filogenia e sucesso evolutivo, ora pela determinação de variações em sua composição dependentes da variabilidade individual, dimorfismo sexual e de sua dieta. No entanto há poucos trabalhos sobre esses animais na literatura. Tendo em vista o potencial biotecnológico e a relevância biológica das toxinas presentes em seus venenos, neste trabalho foi realizado um estudo proteômico quantitativo dos venenos de machos e fêmeas das aranhas Acanthoscurria gomesiana e Acanthoscurria juruenicola através de técnicas proteômicas para ambas as espécies e análise transcriptômica de A. juruenicola, além de ensaios de atividade antimicrobiana de peptídeos purificados. A análise transcriptômica das glândulas de veneno de fêmeas de A. juruenicola resultou em 88.335 sequências de proteínas obtidas a partir da tradução dos respectivos cDNAs. Digestões dos venenos brutos com tripsina e com termolisina seguidas por análises por espectrometria de massas por duas abordagens diferentes de aquisição, data-dependent acquisition (DDA) e data-independent acquisition (DIA), foram realizadas, tendo sido possível identificar 353 proteínas nos venenos de A. juruenicola e 188 nos venenos de A. gomesiana por meio de sequenciamento de novo automático e busca em banco de dados. As quantificações absolutas por DIA das proteínas presentes nos venenos demonstraram uma prevalência de toxinas como proteases ricas em cisteína (CRISPs), theraphotoxinas, metaloendopeptidases, lipases, hialuronidases, tirosina-fosfatase e metalocarboxipeptidases. Uma das theraphotoxinas de A. juruenicola, possui homologia completa com o peptídeo já descrito de Acanthoscurria paulensis (U1-theraphotoxin-Ap1a), enquanto que uma nova theraphotoxina de A. gomesiana, a Ag1a, foi completamente caracterizada. Fracionamento do veneno bruto por gel filtração para a separação de peptídeos (1-7 kDa) foi realizada, possibilitando o isolamento e caracterização das theraphotoxinas de A. gomesiana e A. juruenicola. Ensaios de atividade antimicrobiana contra uma levedura (Candida albicans) e três bactérias, sendo duas Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli) e uma Gram positiva (Micrococcus aureus) foram realizados com esses peptídeos e as concentrações mínimas inibitórias (minimum inhibitory concentration, MIC) foram determinadas para as duas theraphotoxinas.
As aranhas apresentam-se como um dos animais venenosos mais bem sucedidos no planeta, contando atualmente com 45.330 espécies dividas em 3957 gêneros e separados em duas subordens: Mesothelae e Opistothelae. As aranhas mais estudadas pertencem à segunda subordem, que é por sua vez dividida em dois grupos com base na posição das quelíceras (Araneomorphae e Mygalomorphae) e são estudadas, dentre outros fatores, por sua relevância médica e biológica. A quelícera é a responsável pela produção e inoculação de uma secreção tóxica produzida pela glândula de veneno, cujo propósito está em subjulgar presas e como proteção contra predadores. O veneno possui diversos componentes comfunções específiccas e atuação sinérgica. Estudos recentes dos venenos desses animais indicaram a presença de proteínas e peptídeos com atividade antimicrobiana contra fungos, bactérias e protozoários, atuação em canais iônicos e ação seletiva contra receptores característicos de vertebrados ou invertebrados, indicando o potencial biotecnológico dessas moléculas. O estudo do arsenal presente nos venenos das aranhas também é relevante para a elucidação da biologia destes animais, ora por facilitar o entendimento de sua filogenia e sucesso evolutivo, ora pela determinação de variações em sua composição dependentes da variabilidade individual, dimorfismo sexual e de sua dieta. No entanto há poucos trabalhos sobre esses animais na literatura. Tendo em vista o potencial biotecnológico e a relevância biológica das toxinas presentes em seus venenos, neste trabalho foi realizado um estudo proteômico quantitativo dos venenos de machos e fêmeas das aranhas Acanthoscurria gomesiana e Acanthoscurria juruenicola através de técnicas proteômicas para ambas as espécies e análise transcriptômica de A. juruenicola, além de ensaios de atividade antimicrobiana de peptídeos purificados. A análise transcriptômica das glândulas de veneno de fêmeas de A. juruenicola resultou em 88.335 sequências de proteínas obtidas a partir da tradução dos respectivos cDNAs. Digestões dos venenos brutos com tripsina e com termolisina seguidas por análises por espectrometria de massas por duas abordagens diferentes de aquisição, data-dependent acquisition (DDA) e data-independent acquisition (DIA), foram realizadas, tendo sido possível identificar 353 proteínas nos venenos de A. juruenicola e 188 nos venenos de A. gomesiana por meio de sequenciamento de novo automático e busca em banco de dados. As quantificações absolutas por DIA das proteínas presentes nos venenos demonstraram uma prevalência de toxinas como proteases ricas em cisteína (CRISPs), theraphotoxinas, metaloendopeptidases, lipases, hialuronidases, tirosina-fosfatase e metalocarboxipeptidases. Uma das theraphotoxinas de A. juruenicola, possui homologia completa com o peptídeo já descrito de Acanthoscurria paulensis (U1-theraphotoxin-Ap1a), enquanto que uma nova theraphotoxina de A. gomesiana, a Ag1a, foi completamente caracterizada. Fracionamento do veneno bruto por gel filtração para a separação de peptídeos (1-7 kDa) foi realizada, possibilitando o isolamento e caracterização das theraphotoxinas de A. gomesiana e A. juruenicola. Ensaios de atividade antimicrobiana contra uma levedura (Candida albicans) e três bactérias, sendo duas Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli) e uma Gram positiva (Micrococcus aureus) foram realizados com esses peptídeos e as concentrações mínimas inibitórias (minimum inhibitory concentration, MIC) foram determinadas para as duas theraphotoxinas.
Descrição
Citação
ABREU, Thiago Ferreira de. Caracterização proteômica, peptidômica e transcriptômica dos venenos de aranhas do gênero acanthoscurria. 2015. 129 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São José dos Campos, 2015.