Caracterização de genes hipotéticos e o papel da enolase da superfície de C. albicans na adesão celular
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Data
2010
Autores
Silva, Richard Cardoso da [UNIFESP]
Orientadores
Briones, Marcelo Ribeiro da Silva [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Resumo
Os agentes antifúngicos de uso corrente na medicina apresentam alta toxicidade e
efeitos colaterais, tem como alvo poucos constituintes celulares, e muitos mecanismos de
resistência já foram descritos. Com o objetivo de identificar potenciais novos alvos para
drogas antifúngicas, duas ORFs hipotéticas de Candida albicans, potencialmente essenciais
e com perfis singulares de expressão foram caracterizados. A ORF CaYlr339c é conservada
em outros fungos do gênero Candida e Saccharomyces, é transcrita nas fases de levedura e
hifa e a presença de seu produto protéico de aproximadamente 18 kDa foi constatada em
extratos celulares de leveduras e hifas de C. albicans a partir de experimentos de western
blot. A ORF CaYdr187c é conservada em poucos representantes do gênero
Saccharomyces, é transcrita apenas na fase de levedura e potencialmente codifica uma
proteína de superfície. Esses dados indicam que as ORFs selecionadas são genes reais e
podem ser bons candidatos para a descoberta de novas funções e para o desenvolvimento
futuro de novos agentes antifúngicos. Numa tentativa de testar o possível papel da proteína
putativa de superfície CaYdr187cp na adesão celular, constatamos que a incubação de
discos de tecido gastrointestinal com a proteína recombinante enolase, utilizada inicialmente
como controle em nossos experimentos, foi capaz de inibir a adesão de C. albicans de
maneira dose dependente em até 70%. O papel da enolase de superfície na adesão celular
foi confirmado a partir da inibição da adesão em até 50% observada com o bloqueio da
superfície de C. albicans com anticorpos anti-enolase. A capacidade de ligação da enolase
de C. albicans ao plasminogênio foi confirmada a partir de experimentos de coimunoprecipitação.
A pré-incubação de C. albicans com esta proteína foi capaz de inibir
parcialmente sua adesão reforçando a idéia de que a enolase realmente esteja mediando à
adesão deste organismo ao tecido gastrointestinal. Em contrapartida, a enolase não foi coimunoprecipitada
com a fibronectina e a pré-incubação de C. albicans com esta proteína
falhou em inibir sua adesão indicando que a inibição observada com a enolase
recombinante não é decorrente do bloqueio da fibronectina no tecido gastrointestinal. Este
trabalho é o primeiro a demonstrar que a enolase presente na superfície de C. albicans está
envolvida em mecanismos de adesão, podendo ser um importante fator de virulência neste
organismo. Assim, esta proteína poderia ser utilizada no desenvolvimento de vacinas ou
estratégias de controles a partir da inibição da adesão de C. albicans ao tecido
gastrointestinal com o intuito de prevenir sua proliferação.
Current antifungal agents in medicine presents high toxicity and collateral effects, targets limited cell constituents and different resistance mechanisms have already been described. In order to identify novel potential antifungal drug targets, two hypothetical Candida albicans genes potentially essential and with singular expression profile have been characterized. The ORF CaYlr339c is conserved among fungal species from Candida and Saccharomyces genus, is transcribed in yeast and hyphae and an approximately 18-kDa protein was identified in hyphae and yeasts C. albicans cell extracts by western blotting. The ORF CaYdr187c is conserved in a few representatives of the Saccharomyces genus, is transcribed only in yeasts and potentially codifies a surface protein. These findings indicate that the selected ORFs are real genes and could be good candidates for the discovery of new functions and the development of new antifungal agents in the future. In an attempt to test the possible role of the putative surface protein CaYdr187cp on cell adhesion, we find out that incubation of the gastrointestinal Murine disks with the recombinant protein enolase, initially employed as a control in our experiments, was able to inhibit C. albicans adhesion in a dose-dependent manner in 70%. The role of surface enolase on cell adhesin was confirmed with the 50% of the adhesion inhibition observed after blocking C. albicans surface with antibodies anti-enolase. The binding capacity of enolase to plasminogen was confirmed by co-immunoprecipitation. Preincubation of C. albicans with this protein partially inhibited the adhesion supporting the idea that enolase is really mediating the adhesion of this organism to gastrointestinal tissues. On the other hand, enolase was not co-immunoprecipitated with fibronectin and pretreatment of C. albicans with this protein failed to inhibit the adhesion, indicating that the observed inhibition with recombinant enolase was not due to the blocking of fibronectin in the gastrointestinal disks. This was the first work to demonstrate that surface C. albicans enolase is involved in cell adhesion, being a potential virulence factor in this organism. Accordingly, this protein could be useful in vaccine development and is a promising candidate for the prevention of C. albicans proliferation by the inhibition of its adhesion. Esta tese é composta de uma Introdução geral e duas partes independentes compostas de: Introdução, objetivos, materiais e métodos, resultados, discussões e conclusões específicas. A primeira parte da tese trata da caracterização parcial de genes hipotéticos de C. albicans e a segunda parte trata do papel da enolase na adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal.
Current antifungal agents in medicine presents high toxicity and collateral effects, targets limited cell constituents and different resistance mechanisms have already been described. In order to identify novel potential antifungal drug targets, two hypothetical Candida albicans genes potentially essential and with singular expression profile have been characterized. The ORF CaYlr339c is conserved among fungal species from Candida and Saccharomyces genus, is transcribed in yeast and hyphae and an approximately 18-kDa protein was identified in hyphae and yeasts C. albicans cell extracts by western blotting. The ORF CaYdr187c is conserved in a few representatives of the Saccharomyces genus, is transcribed only in yeasts and potentially codifies a surface protein. These findings indicate that the selected ORFs are real genes and could be good candidates for the discovery of new functions and the development of new antifungal agents in the future. In an attempt to test the possible role of the putative surface protein CaYdr187cp on cell adhesion, we find out that incubation of the gastrointestinal Murine disks with the recombinant protein enolase, initially employed as a control in our experiments, was able to inhibit C. albicans adhesion in a dose-dependent manner in 70%. The role of surface enolase on cell adhesin was confirmed with the 50% of the adhesion inhibition observed after blocking C. albicans surface with antibodies anti-enolase. The binding capacity of enolase to plasminogen was confirmed by co-immunoprecipitation. Preincubation of C. albicans with this protein partially inhibited the adhesion supporting the idea that enolase is really mediating the adhesion of this organism to gastrointestinal tissues. On the other hand, enolase was not co-immunoprecipitated with fibronectin and pretreatment of C. albicans with this protein failed to inhibit the adhesion, indicating that the observed inhibition with recombinant enolase was not due to the blocking of fibronectin in the gastrointestinal disks. This was the first work to demonstrate that surface C. albicans enolase is involved in cell adhesion, being a potential virulence factor in this organism. Accordingly, this protein could be useful in vaccine development and is a promising candidate for the prevention of C. albicans proliferation by the inhibition of its adhesion. Esta tese é composta de uma Introdução geral e duas partes independentes compostas de: Introdução, objetivos, materiais e métodos, resultados, discussões e conclusões específicas. A primeira parte da tese trata da caracterização parcial de genes hipotéticos de C. albicans e a segunda parte trata do papel da enolase na adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal.
Descrição
Citação
SILVA, Richard Cardoso da. Caracterização de genes hipotéticos e o papel da enolase da superfície de C. albicans na adesão celular. 2010. 161 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2010.