Caracterização cinética e funcional do inibidor recombinante de FXa da coagulação sanguínea, estraído a partir da glândula salivar do carrapato Amblyomma cajennense(Acari: Ixodidae) (Fabricius, 1787)
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Data
2007
Autores
Simons, Simone Michaela [UNIFESP]
Orientadores
Chudzinski-Tavassi, Ana Marisa [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Muitas substâncias anticoagulantes provenientes da secreção salivar e das glândulas salivares de diversas espécies de carrapatos têm sido relatadas. Através de métodos de bioquímica clássica, previamente foram isolados da saliva do carrapato Amb!Jomma eqjenneme 2 inibidores de FXa, um de trombina e outro da agregação plaquetária. No presente trabalho, um inibidor de FXa foi isolado da saliva através de uma cromatografia de troca iônica em resina Resource -Q (Sistema FPLC- GE), o qual foi denominado INFXa, é capaz de inibir a atividade amidolítica do FXa sobre o substrato cromogênico específico S-2765 (IC50 = 0,2 /-lg) de maneira dose-resposta além de prolongar o tempo de tromboplastina parcial ativada do plasma humano. A inibição do FXa não é alterada pelo INFXa na presença do zimogênio (FX). Através de um gel bidirnensional da saliva 110 spots foram revelados, sendo que suas massas moleculares variaram de 110 a 9 kDa e o pl entre 3.5 a 9.6. Entretanto, uma maior quantidade de proteínas se localizaram entre pl de 4.0 a 7.0 sugerindo um caráter mais ácido à saliva. As seqüências de aminoácidos de oito spots foram obtidas através da espectrometria de massa (MALDI-TOF e Q-TOF), as quais apresentaram similaridade com hemoglobina de manúferos, mas não com inibidores já conhecidos. A partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amb!Jomma cajennense foi previamente clonado e expresso um importante inibidor denominado Amblyomin X, que inibe o FXa da coagulação como induz a remissão de tumor de melanoma implantado em camundongo, sem contudo afetar células normais. O Amblyomin-X foi inicialmente expresso em E.eoli transformada com o vetor de pAE o qual insere uma cauda de 6 resíduos de histidina à molécula. Como o Amblyomin-X foi obtido contendo cauda de poli histidina o que dificulta a validação do sistema para testes pré-clínicos. Neste trabalho avaliou a expressão de Amblyomin-X expresso em PÚhia pastoris. O inibidor foi então expresso em sistema de levedura utilizando a Piehia pastoris tendo como vetor o pPIC9K. Este sistema oferece a vantagem de produzir o inibidor sem a cauda de histidina e ser um processo escalonável. Foram produzidos 5,0 litros do inibidor em um fermentador. O Amblyomin-X foi separado do meio de cultura por dois processos distintos de clarificação, por membranas de fibra oca e por centrifugação, ambos os materiais foram parcialmente purificados através de uma cromatografia de troca iônica em resina Source Q (Sistema AKTA purifier - GE) em sistema rastreável e validado. O Amblyomin-X expresso em de levedura inibiu a atividade amidolítica do FXa sobre o substrato cromogênico S-2765 (Ki= 0,6 uM), e prolongou o tempo de tromboplastina parcial ativada de maneira dose-dependente, a inibição do FXa foi alterada pelo Amblyomin-X na presença do zimogênio (FX) na reação, reproduzindo as atividades encontradas no Amblyomin-X expresso...(au).
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.]: 2007. 151 p.