Estudos de componentes de Trypanosoma cruzi envolvidos na invasao celular por formas amastigotas extracelulares

Abstract

Na primeira parte do trabalho, foi avaliada uma hipotese previamente levantada no laboratorio de que a maior expressao do epitopo de carboidrato presente em Ssp-4 e definido pelo AcM 1 09 estaria relacionada com a maior infectividade de formas amastigotas extracelulares de Trypanosoma cruzi. Para tanto, estudou-se por citometria de fluxo, imunofluorescencia e immunoblotting a expressao e distribuicao deste epitopo em amastigotas extracelulares de isolados de pacientes chagasicos, utilizando como controle as cepas G e CL. Neste contexto avaliou-se tambem o epitopo definido pelo AcM 287 que tambem reconhece carboidrato em Ssp-4. Os resultados obtidos com os ensaios de invasao associados a citometria de fluxo e immunoblotting mostraram que embora ambos os epitopos de carboidrato estejam envolvidos na invasao celular por amastigotas extracelulares, provavelmente por facilitar a adesao do parasita a proteinas com atividade lectinica na celula hospedeira, a maior expressao do epitopo definido pelo AcM 109 nao esta diretamente relacionada com a maior infectividade de amastigotas extracelulares dos isolados de pacientes chagasicos. Na segunda parte, portanto, procurou-se triar componentes do parasita que pudessem estar envolvidos na invasao celular, modulando-a. Lancou-se mao da tecnologia de microarranjo de ONA, utilizando como material de partida RNA polissomal de amastigotas extracelulares das cepas G e CL. Obteve-se com esta abordagem 204 sequencias mais expressas na cepa G e 106 na cepa CL. Como os amastigotas da cepa G sao mais infectivos, procurou-se nas sequencias hipoteticas e hipoteticas conservadas mais expressas nesta cepa, sequencias que codificassem para proteinas que fossem secretadas ou ancoradas a membrana celular. Esta predicao foi realizada por meio de programas disponiveis na rede mundial de computadores. Selecionou-se, portanto, uma sequencia que codifica para uma proteina de 21 kDa (P21) e que apresentou grande probabilidade de ser secretada. Apos clonagem desta proteina, os resultados obtidos foram que a P21 e uma proteina ubiqua e secretada por formas amastigotas extracelulares. Sua forma recombinante (Hiss-P21) aderiu a superficie de celulas HeLa de forma dose dependente, mas nao induziu sinal de calcio em celulas NRK. Em ensaios de invasao celular, observou-se que HiS6-P21 inibiu a invasao por amastigotas extracelulares das cepas G, CL e do isolado 588. Por outro lado, o AcM 2C6 (anti-HiS6-P21) inibiu a invasao da cepa G e do isolado 588, mas nao da cepa CL. Concluiu-se que a P21 pode estar envolvida na invasao celular, sendo provavelmente secretada na justaposicao parasita-celula hospedeira e induz eventos de sinalizacao ainda desconhecidos culminando com a internalizacao do parasita