Utilizacao do sistema de phage display para selecao de peptideos potencialment uteis na inibicao da enzima N-desacetilase-N-sulfotransferase-1

Abstract

A biossintese de heparam sulfato e heparina (HS/HEP) compartilha a mesma via e inicia com a ligacao de um tetrassacarideo ligado a um esqueleto proteico, o que e realizado por quatro enzimas diferentes. O passo seguinte e a adicao alternada de residuos de N-acetil¬glucosamina (GlcNAc) e acido uronico (β-D-acido glucuronico ou α-L-acido iduronico) por polimerases pertencentes a familia denominada EXT. As reacoes de modificacao na biossintese sao iniciadas por uma enzima bifuncional N-deacetilase-N-sulfotransferase (NDST), que possui quatro isoformas e usa o doador 3'-fosfoadenosil-5'-fosfosulfato (PAPS), para transferir um grupo do sulfato para um residuo especifico de glucosamina apos a remocao do acetil em C2. Esta modificacao e seguida pelo epimerizacao em C5 de residuos adjacentes de acido glucuronico para acido iduronico e pela O-sulfatacao em varias posicoes. A maioria das enzimas envolvidos na biossintese de glicosaminoglicanos sulfatados foram clonadas e purificadas, porem os mecanismos que controlam tais processos ainda nao foram elucidados. Em nossos estudos utilizamos o sistema de phage display para a selecao de peptideos ligantes da isoforma NDST-1. Os peptideos selecionados podem regular a atividade de tal enzima e desse modo elucidar o controle da biossintese do HS/HEP. A biblioteca de bacteriofagos utilizada em nossos ensaios consiste de 10 aminoacidos flanqueados por duas cisteinas, expressos na proteina pIII do capsideo de bacteriofagos. Cinco etapas de ligacao foram realizadas utilizando a biblioteca e a enzima recombinante NDST-1. Clones especificos foram selecionados e a sequencia peptidica determinada. Esse metodo de selecao identificou dois peptideos repetitivos CRGWRGEKIGNC e CNMOALSMPVTC, os quais foram testados em ensaios de enzimaticos, clonados e expressos em bacteria BL-21. Os resultados mostraram que o peptideo NMOALSMPVT inibe a atividade enzimatica da NDST-1 recombinante em ate 90 por cento, enquanto o peptideo RGWRGEKIGN apresentou um efeito inibitorio maximo de 40 por cento. Ainda, ensaios de ligacao com heparina-sepharose evidenciaram que o peptideos RGWRGEKIGN se liga a heparina sugerindo uma possivel interacao com o substrato da reacao enzimatica. Enquanto, o peptideo NMOALSMPVT nao mostrou afinidade por heparina e, portanto, podemos hipotetizar que tal peptideo possa estar se ligando ao sitio ativo da enzima, tendo em vista a especificidade dos ensaios de ligacao. Clonamos e expressamos ambos peptideos em sistema de expressao GST e obtivemos um bom rendimento do peptideo recombinante. Os resultados obtidos abrem perspectivas para varias outras investigacoes que certamente poderao esclarecer mecanismos de controle da biossintese do HS/HEP