Identificação dos metabólitos secundários da planta Erythrina falcata Bentham: avaliação na modulação da memória do medo condicionado

Abstract

O presente trabalho teve como objetivo a identificacao dos metabolitos secundarios do extrato bruto de Erythrina falcata (CE) e a analise do efeito destas substancias na aquisicao e na extincao do medo condicionado. Para a identificacao foram utilizadas tecnicas de dereplicacao como cromatografia liquida de alta performance acoplada ao espectrometro de massa letrospary (HPLC-ESI/MS), cromatografia liquida de alta performance/arranjo diodo (HPLC-DAD) e ressonancia magnetica nuclear (RMN). Para a analise do medo condicionado utilizamos os testes de esquiva inibitoria (IA), esquiva discriminada (Labirinto em cruz elevado modificado) e da resposta emocional condicionada (REC). Assim, ratos, Wistar, machos, adultos, foram submetidos ao estudo de bioatividade-guiada do CE, utilizando o teste da IA. Apos a identificacao dos componentes bioativos, foi realizado um fracionamento do CE, onde se obteve a fracao butanolica (BUF), novamente foi realizado um fracionamento obtendo as subfracoes (BuF1-BuF6) e fracao enriquecida em flavonoides (FfA e FfB). Outro grupo de animais foi submetido ao teste da REC. Os animais foram tratados, 30 min antes do condicionamento, com solucao veiculo (Tween® ou salina), FfB (0.15 mg.Kg-1, 0.30 mg.Kg-1 ou 0.65 mg.Kg-1), agonistas dos receptores GABAA (0.4 mg.Kg-1 Diazepam), serotonina-5HT1A (10,0 mg.Kg-1 Buspirona,) ou do glutamato NMDA (10 mg.Kg-1 acido N-metil-D-aspartato); antagonistas GABAA (0,75 mg.Kg-1 Picrotoxina), 5HT1A (0.3 mg.Kg-1 Sway100135) ou NMDA-GluN2B (3,0 mg.Kg-1Ro256981) ou, ainda, antagonistas+FfB. Adicionalmente, nos investigamos o efeito da vitexina, vicenina-2, isovitexina e 6-C-glicosideo-diosmetina na esquiva discriminada. De acordo com o perfil cromatografico, o CE e rico em flavonas, a partir do qual foram identificadas seis substancias (vicenina-2, vicenin-1, isovitexina, vitexina, 6-C-glicosideo-diosmetina e apigenina). O estudo de bioatividade-guiada demonstrou que o tratamento com CE (250 mg.Kg-1 e 500 mg.Kg-1, P<0,0001), BuF (145mg.Kg-1, P<0,0001), BuF3 (21mg.Kg-1, P<0,0001), BuF4 (45mg.Kg-1, P<0,0001), vitexina (0,25 mg.Kg-1, P<0,0001), isovitexina (0,25 mg.Kg-1, P<0,0001), 6-C-glicosideo-diosmetina (0,1 mg.Kg-1, P <0.0001) e fracao flavonoidica A e B (0,65 mg.Kg-1 e 1,0 mg.Kg-1 P<0,0001 respectivamente) aumentam a latencia de descida da plataforma em IA, indicando melhora na aquisicao do medo, sem impedir a aquisicao da extincao do medo avaliado em testes realizados 24h,48h,72h, 10 dias e 21 dias. Ainda, os dados mostram que o tratamento com as diferentes doses da FfB nao interfere na aquisicao do medo, avaliada na REC, entretanto, aumenta a recuperacao espontanea, avaliada 48 e 72 horas apos o teste (P<0,0001). Ainda, mostram pela primeira vez, que o efeito da FfB na recuperacao espontanea do medo condicionado e modulado pelo receptor 5HT1A. Este efeito e revertido pelo tratamento com (S)WAY100135+FfB (P<0,0001). Ainda, o tratamento com Ro25-6981 ou Diazepam prejudicou a aquisicao do medo condicionado. O mesmo nao foi observado para ratos tratados com Ro25-6981+FfB ou Pictrotoxina+FfB (P>0.05). A analise da expressao dos genes para subunidades especificas dos receptores em estudo, em amostras do hipocampo dorsal, realizadas pela tecnica de qPCR, mostrou aumento da expressao do Grin2a, Gabra5 e 5ht1a em grupos tratados com FfB (P<0,0001), e aumento a expressao de Erk1/2 (P<0.0001). Estes genes foram modulados pelos tratamentos com agonistas e antagonistas dos receptores em estudo, corroborando com os nossos achados. Quando submetidos a esquiva discriminada, animais tratados com isovitexina permaneceram mais tempo nos bracos abertos, indicando efeito ansiolitico. O Tratamento com a isovitexina e 6-C-glicosideo-diosmetina nao interferiu na memoria de curto e aumentou a retencao da memoria, avaliada neste teste (P<0,0001). Os resultados obtidos no estudo de docagem no sitio de ligacao dos benzodiazepinicos no receptor GABAA suportam os nossos achados para a atividade mnemonica dos compostos isolados. Em conjunto, os dados sao importantes, pois pela primeira vez na literatura foi realizada a identificacao dos metabolitos presentes na planta Erythrina e uma substancia nova foi identificada no genero. Este estudo apresenta novas evidencias para a participacao dos flavonoides, na memoria do medo condicionado, sugerindo que a FfB modula os diferentes sistemas de neurotransmissao, sendo as vias serotoninergica e glutamatergica um importante alvo de acao. Ainda, que a FfB apresenta um potencial terapeutico para o tratamento de deficit cognitivo