Efeito do fulvestranto sobre a expressão de genes relacionados com a organização do epitélio epididimário de ratos.

Abstract

O epididimo desempenha um papel fundamental para o transporte, maturacao, protecao e estocagem dos espermatozoides. Essa funcao e garantida pelo epitelio altamente especializado, dividido em segmentos u segmento inicial, cabeca, corpo e cauda u que apresentam propriedades absortivas, secretorias, e expressao genica bastante diferenciadas entre si. O controle da funcao epididimaria e exercido principalmente pelos androgenos, mas algumas evidencias sugerem que os estrogenos tambem podem participar da regulacao da funcao desse tecido. O tratamento com o antiestrogeno fulvestranto tem sido uma ferramenta importante para esclarecer as funcoes do estrogeno no sistema reprodutor masculino e os seus efeitos mimetizam, muitas vezes, os do knockout do receptor de estrogeno ESR1. Em ductulos eferentes de rato o tratamento com antiestrogeno, alem de afetar de maneira prevista a expressao de genes relacionados com transporte ionico e absorcao de fluidos, tambem altera a expressao de genes importantes para a organizacao e manutencao do epitelio, entre eles: metaloproteinase 7 (Mmp7), beta-catenina (Ctnnb1), claudina 7 (Cldn7), caderina 13 (Cdh13), e prominina 2 (Prom2). O objetivo do presente estudo foi avaliar se a expressao desses genes, e a de um gene paralogo a Prom2 (Prom1), assim como a expressao das respectivas proteinas, estariam alteradas em epididimo de ratos pelo tratamento com antiestrogeno. Ratos Wistar de 30 dias de idade foram tratados, durante dois meses, com oleo de amendoim (Grupo controle) ou com fulvestranto, na dose de 10 mg/animal, 1 vez por semana (Grupo fulvestranto). Ao termino do tratamento, os animais foram sacrificados e os epididimos foram removidos para determinacao da expressao genica, por PCR quantitativo em tempo real, e da expressao proteica, por Western blot e/ou imunohistoquimica. O tratamento com fulvestranto nao alterou de forma significativa os niveis de RNA mensageiro para Mmp7, em contraste com o aumento de 14X observado nos ductulos eferentes. Entretanto, o tratamento aumentou marcadamente a expressao da proteina no segmento inicial e cabeca do epididimo, que sao regioes com intensa atividade endocitica e secretoria. A localizacao predominantemente supranuclear da proteina sugere que ela pode desempenhar papel na regiao apical e/ou ser secretada para o lume. Na regiao apical poderia regular proliferacao celular, liberacao de fatores de crescimento, clivagem de proteinas de juncoes, entre elas a ocludina e a E-caderina, com possivel repercussao na resistencia das tight junctions e na organizacao da barreira hematoepididimaria. No lume epididimario, poderia contribuir para a apoptose espermatica e clivagem de proteinas da superficie do espermatozoide. O tratamento com fulvestranto nao alterou a expressao genica relacionada a outras proteinas de juncoes, como Ctnnb1 e Cldn7, mas diminuiu a expressao genica e proteica de CDH13. A diminuicao da expressao genica ocorreu principalmente na regiao do corpo, a mais rica em receptor de estrogeno ESR1. CDH13 pode participar tanto de mecanismos de adesao celular como de transducao de sinal, como ocorre com outras proteinas complexadas a glicosilfosfatidilinositol. Os dois genes paralogos, Prom1 e Prom2, parecem ser diferencialmente regulados em ductulos eferentes e nos diferentes segmentos do epididimo. O tratamento com fulvestranto tendeu a diminuir a expressao genica de Prom1 (principalmente da variante 1, em todas as regioes do epididimo, e da variante 2, na regiao da cauda). A analise por Western blot mostrou uma reducao da expressao da PROM1 na regiao do segmento inicial/cabeca, e a imunohistoquimica revelou que o tratamento com o antiestrogeno favoreceu a localizacao da proteina nas microvilosidades das regioes da cabeca e do corpo do epididimo, sugerindo que pode haver um favorecimento da secrecao de vesiculas contendo PROM1 para o lume, o que poderia favorecer a sua incorporacao ao flagelo do espermatozoide, observada na regiao do corpo do epididimo. O tratamento com fulvestranto tambem tendeu a diminuir a expressao genica de Prom2, principalmente nas regioes do corpo e da cauda, mas a analise por Western blot nao revelou nenhuma alteracao do conteudo proteico. Entretanto, a imunohistoquimica revelou um leve aumento da expressao da proteina na regiao da cauda e foi possivel passar a detectar a expressao de PROM2, que era praticamente ausente na regiao da cabeca do epididimo. Em estudo anterior foi observado que o mesmo tratamento com fulvestranto aumentou a expressao do receptor de androgeno AR em todas as regioes do epididimo, especialmente no segmento inicial e cabeca, e a expressao do receptor de estrogeno GPER, na regiao do corpo e da cauda. Alem disso, o tratamento com fulvestranto dimininuiu o nivel tecidual de testosterona e aumentou o de estradiol, na cabeca e na cauda do epididimo. Portanto, e possivel que essas alteracoes tambem tenham um papel na regulacao dos diferentes alvos analisados no presente estudo. Em conclusao, o bloqueio da acao estrogenica afeta a expressao de proteinas importantes para a organizacao epitelial e secrecao epididimarias. A sensibilidade a estrogeno parece variar entre as diferentes regioes do epididimo e essa diversidade regulatoria pode ser importante para controlar funcoes especificas de cada regiao