Investigacao de cininogenases endogenas em modelos celulares: caracterizacao parcial e interacao com cininogenio humano de alta massa molecular

Abstract

A ligacao dos cininogenios as celulas e importante no acumulo de precursores das cininas na superficie das celulas alvo. A interacao entre o cininogenio de alta massa molecular (HK) e a superficie celular resulta na sua hidrolise e captura mediada por proteoglicanos (PGs). Nessas condicoes o peptideo vasoativo bradicinina (BK) e liberado por enzimas da classe serino ou cisteino proteases. O presente trabalho tem como objetivo purificar, identificar e caracterizar enzima (s), envolvidas no processamento celular do HK em linhagens celulares CHO-K1 selvagem e CHO-745 mutante deficiente na producao de PGs. As fracoes de membrana e lisados celulares foram preparados por sonicacao e centrifugacao, e a atividade cininogenasica foi ensaiada em tampao pH 5,5 ou pH 7,4 a 37ºC por 4 h. O HK intacto ou seus fragmentos foram analisados por imunodeteccao usando anticorpos policlonal anti-HK, e monoclonais anti-BK e anti-HKL1 (HKD6). As proteinas presentes nos lisados de ambas as linhagens celulares foram separadas por cromatografia de afinidade em resina antipaina-Sepharose. A fracao de lisado de CHO-K1 apresentou melhor especificidade sobre o HK integro em pH 5,5 e aquela preparada a partir de CHO-745 hidrolisou o HK integro em ambos pH 5,5 e 7,4; ambas as fracoes de membrana apresentaram atividades cininogenasicas nos valores de pH 5,5 e 7,4. Em zimogramas as fracoes de CHO-K1 nao retida e retida em resina antipaina-Sepharose apresentaram atividades proteoliticas sobre caseina ou gelatina apenas em pH 7,4 e as proteinas da fracoes de CHO-745 nao retida e retida apresentaram atividades proteoliticas apenas sobre caseina em pH 7,4. As fracoes de CHO-745 hidrolisaram totalmente o HK integro, em cadeias pesada e leve, esta contendo o dominio D6 (T503-S626), com liberacao de BK e independente do pH do meio. As fracoes obtidas de CHO-K1 hidrolisaram o HK integro em cadeias pesada e leve, independente do pH, com menor especificidade comparada as fracoes de CHO-745 e apenas a fracao nao retida nao liberou BK. A analise do sequenciamento de proteina presente nas fracoes nao retidas de CHO-K1 e CHO-745 identificou a proteina isolada como pertencente a familia das novas proteinas nucleares ricas em residuos cisteina/serina (CSRNP). A atividade cininogenasica de CHO-K1, sem liberacao de BK, pode ser atribuida a uma metaloprotease. Os resultados obtidos com as linhagens celulares, que diferem quanto a producao de PGs, permitem concluir que os GAGs exercem acao nao somente nos mecanismos de interacao mas tambem de processamento celular do HK