Isolamento e caracterizacao funcional de novos substratos naturais para a endopeptidase 24.15, neurolisina e enzima conversora de angiotensina

Abstract

Endopeptidase 24.15 (EC 3.4.24.15; ep24.15), neurolisina (EC 3.4.24.16; ep24.16) e enzima conversora de angiotensina (EC 3.4.15.1; ECA) sao metalopeptidases envolvidas no metabolismo de neuropeptideos em vertebrados. Nesse trabalho geramos mutantes cataliticamente inativos para as enzimas ep24.15 e ep24.16, com o objetivo de utiliza-las no isolamento de novos substratos naturais. Experimentos de dicroismo circular e de ligacao com peptideos conhecidos, utilizando as enzimas selvagens ou inativas recombinantes, confirmaram suas integridades estruturais, bem como a manutencao da capacidade de reconhecer peptideos. Utilizando as enzimas recombinantes cataliticamente inativas foi possivel, com auxilio de cromatografia de exclusao molecular a seco, isolar varios novos peptideos presentes no homogenato total de cerebro ou baco de ratos. Estes peptideos foram separados por cromatografia liquida de alta resolucao (HPLC), sequenciados por espectrometria de massa (Q-TOF, MicroMass), e identificados como possiveis fragmentos de proteinas intracelulares, tais como a hemoglobina. Tres destes peptideos (PVNFKFLSH, VVYPWTQRY e LVVYPWTQRY) foram sintetizados e mostraram uma interacao com a ep24.15, ep24.16 e ECA, com Ki 's variando entre 1.86 M e 27.76 M. O peptideo PVNFKFLSH, denominado por nos hemopressina, produziu uma hipotensao dose-dependente em ratos anestesiados, iniciando com doses de 0.001 g/kg. O efeito hipotensivo deste peptideo foi demonstrado ser potencializado pelo enalapril. Esses dados resultados sugerem que a hemopressina seja uma nova substancia vasoativa in vivo. Dessa forma, nossos resultados contribuiram para a identificacao de um novo peptideo vasoativo, bem como para o desenvolvimento de um novo metodo que permitiu o isolamento de novos substratos naturais para as ep24.15, ep24.16 e ECA