Sinalização celular pela ativação do receptor AT1 da angiotensina II permanentemente transfectado em células CHO: estudos com mutações sitio-dirigidas

Abstract

Mutaçoes do receptor AT1 da angiotensina II (AII) foram designadas para determinar a importância dos resíduos alifáticos na regiao C-terminal de hélice VI e no segmento proximal da alça extracelular EC-3. Células CHO expressando os mutantes puntuais L262D, L265D e L268D foram utilizadas pare ensaios de ligaçao e ativaçao. Mutaçoes pelas substituiçoes do resíduo Leu268 no domínio extracelular EC-3 e do Leu262 no domínio transmembrana, por resíduo aspartil, nao causaram significantes variaçoes na afinidade do receptor à AII e aos antagonistas, peptídico Sar1Leu8 Ali e nao-peptídico DuP 753 e na produçao de IP. Em contraste, a mutaçao puntual L265D, na hélice VI, reduziu drasticamente a afinidade e a capacidade de estimular a hidrólise de fosfatidilinositol. De acordo com um novo modelo molecular do receptor AT1 que foi construído em homologia com a recentemente obtida estrutura da rodopsina, Leu268 está na inserçao da alça extracelular EC-3, mas Leu262 e Leu265 estao ambos na porçao C-terminal transmembrana da hélice VI, com as cadeias laterais apontando para fora. Os dados experimentais analisados à luz desse modelo, permitem sugerir que: (1) diferentemente do Leu262, Leu265 tem a sua cadeia lateral voltada para uma fenda formada entre as hélices V e VI na regiao periplasmática do receptor, aparentemente participando de um arranjo estrutural que poderia ter um papel crítico para estabilizar a interface receptor-membrana; (2) esse arranjo estrutural que foi impedido pela carga negativa da cadeia lateral de Asp poderia ser um fator determinante para orientar a regiao de ligaçao do agonista, que contém resíduos importantes para ligaçao Lys199 da hélice V e His256 da hélice VI para uma conformaçao favorável para ligaçao e ativaçao