Clonagem molecular e expressão de reprolisinas da glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca

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Data
2001
Autores
Silva, Carlos Alberto da [UNIFESP]
Orientadores
Camargo, Antonio Carlos Martins de [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
As metaloendopeptidases hemorrágicas dos venenos de serpentes (SVMPs), têm sido amplamente estudadas e demonstram açao direta sobre os componentes hemostáticos e a hemorragia, durante o envenenamento. Atualmente, sao agrupadas na família das reprolisinas juntamente com as proteínas reprodutivas de mamíferos e, de acordo com suas estruturas de multidomínios, sao subdivididas em 4 classes: P-I a P-IV. 0 fator hemorrágico HF3 é uma metaloendopeptidase isolada do veneno de B. jararaca, que apresenta dose mínima hemorrágica de 15 ng suficiente para causar a hemorragia de 1 cm z na derme de coelho. Sua atividade hemorrágica é dependente das suas pontes dissulfeto e da presença do átomo de zinco em seu centro ativo. E uma glicoproteína ácida (pI 3,9), que em condiçoes de desnaturaçao e reduçao apresenta massa molecular de 62 000 Da. A clonagem molecular do HF3 foi realizada inicialmente, pela técnica de immunoscreening da bMoteca cie cDNAs da glândula de veneno da B, jararaca, utilizando-se um soro anti-HF3. 0 clone isolado 6.1.1 de 1467 pb correspondeu a seqüência parcial do precursor do HF3. A autenticidade desse clone, foi confirmada pelo sequenciamento de aminoácidos de peptídeos internos oriundo da clivagem com endopeptidase Lys-C do HF3 nativo. Com o intuito de isolar o precursor completo do HF3, selecionamos duas técnicas alternativas de screening da biblioteca d cDNA, baseando-se no método de screening por PCR e a hibridizaçao de ácidos nucléicos com sonda de DNA marcada com digoxigenina. 0 sequenciamento parcial de nucleotídeos dos clones isolados, mostrou que todos codificam meta loendopeptidases, entretanto, 80 por cento corresponderam a precursores já descritos e os demais nao possuíram homologia com o HF3. De acordo com esses resultados, utilizamos dois métodos para tentar obter a regiao 5 que completaria o cDNA parcial do HF3, através da amplificaçao por PCR com oligonucleotídeos específicos para o HF3 e técnica de 5 RACE. 0 sequenciamento dos clones isolados permitiu identificar 3 clones obtidos pela técnica de VRACE. Todos possuem 974 pb, que codificam a extremidade 5 do HF3, pois 194 pb da porçao 3 sobrepoem-se com a porçao_(au).
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2001. 162 p. ilus.