Purificação e caracterização de duas aminopeptidases de sementes de Zea mays

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Data
2001
Autores
Kikuti, Carlos Massayuki [UNIFESP]
Orientadores
Alves, Kaethy Bisan [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
As aminopeptidases estao amplamente distribuidas, tanto no reino animal como no vegetal. Elas sao enzimas que hidrolisam ligacoes peptidicas da porcao N-terminal de peptideos, e tambem hidrolisam aminoacil-a-naftilamidas (AA-NA) e aminoacil-p-nitroanilidas (AA-Nan). A atividade aminopeptidasica e encontrada somente nas regioes do embriao e aleurona das sementes de Zea mays. Tambem foi verificado que o extrato de embrioes apresenta maior quantidade de atividade aminopeptidasica por grama do que o extrato de cotiledones. Do sobrenadante do extrato de embrioes, duas enzimas foram purificadas (LAP e RAP) por cromatografia de troca ionica, gel filtracao e interacao hidrofobica. As duas enzimas foram separadas somente pela ultima cromatografia. Na SDS-PAGE, as duas aminopeptidases apresentaram somente uma banda proteica cada, na presenca ou na ausencia de agente redutor, ambas com massa moleculare de 110 kDa. A homogeneidade da LAP foi verificada por HPLC em coluna C-18, sendo eluido apenas um pico proteico com 53,705 min de tempo de retencao, primeiramente com um gradiente linear simultaneo de concentracao de acetonitrila (4,5 - 6,3 por cento) e isopropanol (1 ,5 - 9 por cento), seguido por 90 por cento de acetonitrila em 0,1 por cento de TFA em agua. A homogeneidade da RAP foi verificada por HPLC em resina C-4, sendo eluido apenas um pico proteico com 51,785 min de tempo de retencao, com um gradiente linear de concentracao de acetonitrila (0 - 90 por cento) em 0,1 por cento de TFA em agua. A LAP de embrioes de milho apresentou valores de KM da ordem de 10-SM para Leu-NA e 10-4M para Met-NA, e nao apresentou atividade sobre Ala-, Arge Glu-NA. Os valores de efiCiência catalitica (VmaX/KM) mostraram que Leu-NA e 25 vezes melhor substrato do que Met-NA. A LAP apresentou as seguintes caracteristicas: pH otimo 7,0; estabilidade a -20, 4 e 25§C por pelo menos 30 dias; absorcao maxima de luz a 595 nm; ativacao por a-mercaptoetanol e ditioeritritol; leve inibicao por ions sodio e calcio; inibicao por ions cobalto e pOHMB; sem inibicao por EDTA, o-PHE, aminoacidos, o-naftilamina, pnitroanilina e bestatina. A RAP de embrioes de milho apresentou valores de KM da ordem de 10-5M para Arg- e Leu-NA e 10-4M para Ala- e Met-NA. Os valores de efiCiência catalitica (Vmax/Kna) mostraram que Arg-NA e cerca de 3 vezes melhor substrato do que Leu-NA; 33 vezes melhor do que Met-NA e 50 vezes melhor do que Ala-NA. A RAP e ativada por ions cloreto e magnesio, nao e inibida por...(au)
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2001. 84 p. ilustab.