Caracterização de ciminases purificadas a partir de urina humana utilizando substratos com apagamento intramolecular de fluorescência

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Data
2000
Autores
Quinto, Beata Marie Redublo [UNIFESP]
Orientadores
Casarini, Dulce Elena [UNIFESP]
Tipo
Dissertação de mestrado
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Resumo
Cininase e uma denominacao geral para enzimas proteoliticas capazes de inativar cininas como bradicinina (BK), lisil-bradicinina (LBK) e metionil-lisil-bradicinina (MLBK). Em estudos anteriores realizados em nosso laboratorio, foram purificadas de urina de individuos normais, atraves de cromatografia em DEAE-celulose, 8 enzimas com atividade cininasica: duas atividades do tipo carboxipeptidase, duas enzimas conversaras de angiotensina I, duas serino endopeptidase (Hl e H2), uma prolil endopeptidase (H) e uma endopeptidase neutra (NEP-Iike). Neste trabalho, com o objetivo de estabelecer um metodo extremamente sensivel para a quantificacao de endopeptidases, purificamos e caracterizamos 4 enzimas, a partir de urina humana, que foram classificadas com base nos estudos de inibicao e ligacao hidrolisada na molecula de BK, como serino tiol endopeptidase (H2), serino endopeptidase (Hl), prolil endopeptidase (H) e endopeptidase neutra (NEP-Iike). Para tanto utilizamos o substrato com apagamento intramolecular da fluorescencia AbzOBKQOEDDnp, bem como testamos diversos substratos fluorogenicos para estudar a especificidade das referidas enzimas. A prolil endopeptidase e uma tiol metalo endopeptidase sendo inibida por EDTA, 2-ME e POHMB. A serino endopeptidase Hl foi inibida por PMSF e a serino tio[ endopeptidase H2 alem de ser inibida por PMSF foi tambem inibida por E64 e POHMB. A NEP-Iike foi inibida por fosforamidom, tiorfam e OPA. Os substratos fluorogenicos Abz-FPQ-EDDnp, Abz-FGQ-EDDnp, AbzFRQ-EDDnp e Abz-FDQ-EDDnp foram determinados especificos para as enzimas H, Hl, H2 e NEP-Iike respectivamente. O Km encontrado foi da ordem de mM para estes substratos, bem como para Abz-BKQ-EDDnp. Utilizando o substrato Abz-BKQ-EDDnp a atividade maxima encontrada para a prolil endopeptidase foi em 9,0; para a serino endopeptidase Hl foi em 7,0 e 8,5, e para a NEP-Iike foi em 7,0 e 8,0. Quando utilizamos os substratos especificos para cada enzima encontramos atividade maxima nos seguintes pHs: 6,5 e 8,0 para a prolil endopeptidase, utilizando o substrato Abz-FPQ-EDDnp; 5,5 e 8,0 para a serino Hl utilizando o substrato Abz-FRQ-EDDnp; e 6,0 e 7,0 para a NEP-/ike utilizando o substrato Abz-FDQ-EDDnp. Para a endopeptidase H2 nao foi possivel determinar o pH otimo de atividade. Os pesos moleculares determinados para a prolil endopeptidase, 45 kDa; para a serino endopeptidase Hl, 49 kDa...(au)
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 2000. 103 p. ilustabgraf.