Evidencias da expressao da fosfolipsae C (PLC-a) de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Um fragmento de DNA de 3,0 kb especie-especifico de Mycobacterium tuberculosis foi identificado a partir de uma biblioteca genomica e sequenciado (Parra et. al., 1991 -, Leao et. al, 1995). A analise por computador desta sequencia revelou a existencia de duas fases abertas de leitura (ORFs)- plc-a e plc-b que apresentaram homologia com genes codificadores de duas fosfolipases C de Pseudomonas aeruginosa. Com o intuito de verificar a expressao da proteina nativa codificada pelo gene plc-a em micobacterias foram realizadas clonagens de fragmentos amplificados por PCR contendo a fase aberta de leitura plc-a nos vetores de expressao pGEX5T e pET23a. As proteinas recombinantes parcialmente purificadas foram utilizadas para imunizar camundongos. Soros de animais imunizados com a proteina recombinante expressa no vetor pGEX5T reconheceram por ELISA GST, expressa em fusao com a proteina PLC-A nesta construcao. Soros de animais imunizados com a proteina nao fusionada expressa no vetor pET23a mostraram reatividade contra a PLC-A recombinante expressa por todas as construcoes obtidas e nao apresentaram reatividade cruzada contra proteinas de E. coli ou GST. Com este soro foi possivel identificar por Westem blot uma proteina de massa molecular de 43 kDa no extrato de Mycobacterium tuberculosis mas nao em extratos de Mycobacterium avium (D4), Mycobacterium bovis (AN5), Mycobacterium kansasii e Mycobacterium smegmatis. O mesmo soro apresentou reatividade contra Mycobacterium tuberculosis em ELISA. Uma outra abordagem para verificar a expressao da proteina nativa foi feita utilizando o vetor PJEM12, que e um plasmidio bifuncional (E. coli-micobacteria) e possui um gene reporter b-galactosidase sem promotor na sua sequencia. Apos a clonagem da sequencia de DNA que precede o gene plc-a e posterior transformacao de M smegmatis com o plasmidio recombinante, foi possivel verificar a atividade de b-galactosidase em micobacterias cultivadas in vitro e em macrofagos infectados com a micobacteria recombinante, sugerindo a presenca de uma sequencia promotora ativa em ambas as condicoes