Caracterização molecular de um antígeno de 30kDa de Leishmania (L.) amazonensis envolvido na resposta imune celular em modelo urino

Abstract

O enfoque do presente trabalho foi a caracterizacao molecular de um antigeno de 30 kDa (p3O) de formas amastigotas de L. (L.) amazonensis implicado em respostas linfoproliferativas em camundongos BALB/c parcialmente protetoras contra a infeccao homologa. A caracterizacao do antigeno envolveu a producao de anticorpos monoclonais dirigido a p3O e entre eles um, denominado AcMo 2E5/D3, mostrou-se reativo tanto com formas amastigotas quanto promastigotas de L. (L.) amazonensis. A utilizacao do AcMo 2E5/D3 em estudos de imunocitoquimica em nivel de microscopia eletronica de cortes ultrafinos de lesoes de pata de hamster infectados com L. (L.) amazonensis mostrou a localizacao preferencial da p3O em megassomos dos parasitas. Foi demonstrada a atividade de cisteina proteinase da p3O apos purificacao do antigeno em coluna de imunoafinidade com o AcMo 2E5/D3 e separacao por PAGE-SDS em gel contendo gelatina em condicoes nao redutoras. Um fragmento do gene codificador da p3O, denominado Lacys23, foi obtido por amplificacao por PCR utilizando-se oligonucleotideos conservados de cisteina proteinases e DNA genomico de L. (L.) amazonensis, sendo posteriormente sequenciado. A analise da sequencia desse fragmento mostrou alto grau de homologia com genes que codificam cisteina proteinases previamente descritas, assim como uma grande identidade com as cisteina proteinases expressas por essas sequencias. A analise genomica do Lacys23 mostrou que provavelmente o gene esta presente em pequeno numero de copias e em um unico locus cromossomico. A subclonagem do fragmento Lacys23 no vetor de expressao PGEX em fase com o gene da glutationa S-transferase gerou uma proteina de fusao de 43 kDa (p43). Essa proteina foi reconhecida por soro hiperimune anti-amastigotas de L. (L.) amazonensis e a reacao de extratos do parasita com soro de camundongo anti-p43 identificou uma proteina de 30 kDa com atividade proteolitica muito semelhante a da p3O nativa. A proteina recombinante foi capaz de induzir respostas proliferativas de linfocitos de camundongos BALB/c previamente imunizados com amastigotas de L. (L.) amazonensis comparaveis a da p3O nativa. A secrecao de IFN-g pelos linfocitos estimulados pela p43 tambem foi observada, sugerindo o envolvimento de linfocitos CD4+ Th1 nessas respostas. Camundongos BALB/c foram imunizados com a forma nativa e recombinante da p3O e desafiados com L. (L.) amazonensis. Resultados previos mostraram a capacidade ...(au)