Malaria experimental no modelo de Plasmodium yoelii
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Data
1997
Autores
Rodrigues, Elaine Guadelupe [UNIFESP]
Orientadores
Travassos, Luiz Rodolpho [UNIFESP]
Tipo
Tese de doutorado
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Resumo
Os principais objetivos deste trabalho foram a determinacao da eficacia do Adenovirus como vetor de expressao de antigenos protetores contra a infeccao pelos esporozoitas de Plasmodium yoelii, e a utilizacao deste sistema para estudos basicos sobre a imunidade induzida no modelo murino. Foi construido um adenovirus recombinante do sorotipo 5, expressando a proteina circumsporozoita (CS) de P. yoelii, designado AdPyCS. O virus recombinante apresenta delecoes nas regioes E1 e E3, nao sendo, portanto, capaz de se replicar na celula hospedeira. Uma dose unica de 109 pfus de AdPyCS por via subcutanea, foi capaz de induzir no animal imunizado niveis elevados de celulas T CD8+ e CD4+ CS especificas, alem de titulos elevados de anticorpos anti-esporozoitas. Esta resposta imune CSP especifica induzida pelo vetor viral reduziu em 93% o desenvolvimento das formas hepaticas nos animais imunizados, com imunidade esteril em 40% deles. Esta foi a primeira demonstracao de um vetor expressando um unico antigeno de plasmodio capaz de induzir, em dose unica, uma resposta protetora tao eficiente. Essa resposta imune associa-se diretamente aos altos niveis de celulas T CD8+ encontradas no baco e figado dos animais imunizados, uma vez que a deplecao in vivo dessa subpopulacao celular reduz em cerca de 60% a inibicao das formas hepaticas do parasita induzida pelo AdPyCS. Anticorpos anti-esporozoitas que reduzem a carga parasitaria que atinge os hepatocitos, bem como celulas T CD4+ participam tambem da resposta imune. AdPyCS e capaz de induzir uma resposta imune protetora de longa duracao, resultado esse de particular importancia para o desenvolvimento de uma vacina. O elevado nivel de inibicao das formas hepaticas persiste pelo menos por 8 semanas em seguida a imunizacao com uma unica dose de AdPyCS, embora o numero de celulas T CD8+ e CD4+, apos esse periodo, esteja acentuadamente reduzido. A inducao de uma resposta imune protetora eficaz pelo AdPyCS, foi comparada a imunogenicidade de esporozoitas irradiados, geralmente utilizados como ogold standardo no estudo dos mecanismos imunes contra as formas pre-eritrociticas da malaria. Embora os dois imunogenos tenham induzido, apos dose unica, numeros de celulas T CSP especificas totalmente diferentes, com titulos similares de anticorpos anti-esporozoitas, a resposta imune protetora de ambos contra um desafio infeccioso de esporozoitas foi muito semelhante. AdPyCS, expressando um unico antigeno malarico, reduziu em 95% a carga parasitaria no figado dos animais imunizados, 40% deles desenvolvendo imunidade esteril. A imunizacao com esporozoitas irradiados, contendo multiplos antigenos, inibiu em 97% as formas hepaticas, com 20% dos animais desenvolvendo imunidade esteril. Utilizando camundongos geneticamente inativados (oknock-outo) para moleculas envolvidas na resposta imune, determinou-se que a imunizacao com AdPyCS induz uma vigorosa resposta imune celular independente de IFN-y, constituida principalmente de celulas efetoras citotoxicas T CD8+ que, provavelmente devido a um ohomingo eficiente, localizam-se preferencialmente no figado e baco dos animais imunizados, inibindo eficientemente as formas intra-hepatociticas do parasita. Em animais deficientes na expressao de IFN-y (IFN-y-/-) ou de seu receptor (IFN-y-R-/-) as celulas T CD8+ citotoxicas induzidas pelo AdPyCS inibem o desenvolvimento de formas pre-eritrociticas do P. yoelii de maneira semelhante a dos animais selvagens. Como a expressao da sintase induzivel de oxido nitrico (iNOS) e regulada pelo IFN-y, a imunizacao com AdPyCS de camundongos deficientes em iNOS, resultou como seria esperado, em uma resposta imune protetora identica a dos animais nao mutados. Camundongos deficientes na expressao de perforina tambem conseguiram inibir eficientemente as formas pre-eritrociticas do parasita apos imunizacao com AdPyCS, sugerindo que o sistema Fas/Fas-ligante esteja ativo como mecanismo efetor citotoxico, induzindo apoptose da celula hepatica infectada. Animais deficientes na expressao de Fas-ligante imunizados com AdPyCS, reduziram em 57% o desenvolvimento das formas intra-hepatociticas, confirmando a participacao do sistema Fas/FasL na resposta imune protetora induzida pelo AdPyCS. A imunizacao previa com esporozoitas irradiados nao alterou o ja elevado numero de celulas T CSP especificas induzido pelo AdPyCS, embora tenha elevado consideravelmente o titulo de anticorpos anti-esporozoitas. Ao contrario, quando a ordem inversa de imunizacao foi utilizada, ou seja, AdPyCS previamente a esporozoitas irradiados, o titulo de anticorpos permaneceu o mesmo, enquanto que o numero de celulas T CSP especificas elevou-se cerca de 1,5 vezes. Resultados previos mostraram que a imunizacao com esporozoitas irradiados de P. yoelii e dependente de IFN-y, nao ocorrendo em animais IFN-y-/-. Apos confirmar essa dependencia, verificamos, surpreendentemente, que os mecanismos efetores da protecao imune independem de iNOS, uma vez que animais deficientes na expressao dessa enzima, quando imunizados, montaram resposta imune protetora equivalente a dos animais nao mutados. O mesmo ocorreu com animais deficientes na expressao do fator de regulacao de IFN-y (IRF-1-/-). Animais deficientes em iNOS inoculados com IFN-y recombinante, seguido de um desafio com esporozoitas viaveis, inibiram o desenvolvimento dos estagios pre-eritrociticos de forma dose dependente, confirmando que IFN-y deva induzir um mecanismo efetor direto no hepatocito, independente da producao de NO. Animais deficientes na expressao de perforina induziram uma resposta imune protetora similar a dos controles selvagens, sendo sugerido que haja uma compensacao eficiente da funcao citotoxica pelo sistema Fas/Fas-ligante, que induz apoptose das celulas alvo, no caso, hepatocitos infectados. Em uma visao global, a imunizacao com esporozoitas irradiados, induz celulas T CD8+ e T CD4+ especificas que, ativadas pelos antigenos parasitarios, respondem com a producao de IFN-y, o qual desencadeia uma resposta protetora intra-hepatocito, altamente eficiente e independente de IRF-1 e iNOS. IFN-y pode tambem regular positivamente a expressao de moleculas de MHC classe I na superficie do hepatocito infectado, estimulando uma resposta imune especifica mediada por celulas T citotoxicas, utilizando provavelmente mecanismos efetores mediados por Fas/FasL e perforina. Finalmente, um outro vetor recombinante, o virus Sindbis, foi ensaiado quanto a sua capacidade de expressar eficientemente epitopos especificos para celulas T CD8+. Demonstrou-se que uma dose unica de SIN.mal, o recombinante expressando o epitopo de celulas T CD8+ da CSP de P. yoelii, induziu um nivel apreciavel de protecao contra a malaria murina. Da mesma forma, SIN.flu, o recombinante expressando um epitopo para celulas T CD8+ da proteina NP de virus da influenza, tambem induziu resposta imune protetora eficaz apos dose unica. Estes resultados sugerem que o virus Sindbis recombinante possa se constituir em outro vetor efetivo para vacinas contra agentes infecciosos intracelulares
Descrição
Citação
São Paulo: [s.n.], 1997. 199 p.