Navegando por Palavras-chave "Sequenciamento"

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    Análise por sequenciamento paralelo maciço da resistência aos antirretrovirais em pacientes infectados pelo HIV-1 em terapia de resgate
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-06-21) Castro, Daniela Funayama de [UNIFESP]; Komninakis, Shirley Vasconcelos [UNIFESP]; Lattes http://lattes.cnpq.br/6529080329230878; http://lattes.cnpq.br/8695544517472892; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Antiretroviral Therapy (ART) has improved the quality and life expectancy of HIV-1 infected individuals, reducing both mortality and morbidity. However, along with ART there was the emergence of resistant viral populations selected by the selective pressure of the drugs. These viral populations may lead the patient to virological failure. Although the success rates of ART are high, patients with virologic failure usually require changes in their antiretroviral regimens, which is called a "rescue therapy". Objectives: 1 - Analyze resistance mutations in samples of patients who failed ART and using rescue antiretrovirals: Darunavir, Etravirine and / or Raltegravir; 2 - Compare the mutational profile obtained by the Massive Parallel Sequencing with the one identified by conventional sequencing - Sanger's method. METHODS: Twenty-eight samples with HIV genotyping results with virological failure of antiretroviral drugs were selected between March 2014 and May 2015. The selected samples were from patients with failed ART and one or more antiretroviral drugs from this study. For the analysis of the samples the Massive Parallel Sequencing was done. Results: The most prevalent mutation among all analyzed was I84V in the protease (39.1%). Among the mutations that reduced susceptibility to Darunavir, after I84V, the most common was L33F, accounting for 26%. In mutations that confer reduced susceptibility to Etravirine, mutations K101P, Y181I and Y181V were identified, representing a frequency of 4.3% each. With regard to Raltegravir, a frequency above 21% of the N155H mutation was observed, which gives a significant reduction in the susceptibility to this drug. Mutations with minority prevalence and TAMs M41L, D67N, K70R, L210W, T215F, T215Y and K219Q were also identified. Conclusion: Minority resistance mutations are not currently identified by the method used in clinical practice, such as population sequencing (Sanger's method), whose detection limit is higher than 20-30%. Massive Parallel Sequencing makes it possible to identify mutations with frequency up to 1%. The analysis of minority mutations could, in some situations, help in the choice of a more adequate antiretroviral.The analysis of minority mutations could, in some situations, help in the choice of a more adequate antiretroviral.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Caracterização molecular e interpretação clínica de rearranjos cromossômicos equilibrados associados com alterações fenotípicas
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2018-02-02) Oliveira, Mariana Moyses [UNIFESP]; Melaragno, Maria Isabel de Souza Aranha [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0678071850781758; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O mapeamento preciso dos pontos de quebra de rearranjos cromossômicos equilibrados associados a alterações fenotípicas pode levar ao reconhecimento de novos loci genômicos associados a doenças e ao melhor entendimento de mecanismos de formação de alterações cromossômicas. O estudo de mulheres com alterações fenotípicas e translocações equilibradas envolvendo o cromossomo X apresenta um potencial ainda maior de contribuir para o entendimento do genoma humano, uma vez que oferece a oportunidade de se avaliar a correlação genótipo-fenótipo levando em consideração a inativação preferencial do cromossomo X normal. O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos patogênicos responsáveis pelas alterações clínicas de pacientes com translocações equilibradas, buscando genes rompidos pelos pontos de quebra ou próximos aos pontos de junção, candidatos para os seus fenótipos. Adicionalmente, objetivou-se avaliar a natureza das sequências rompidas pelas quebras cromossômicas e as cicatrizes deixadas nos pontos de junção. Primeiramente, 11 pacientes com translocações equilibradas e fenótipo alterado tiveram seus pontos de quebra mapeados por metodologias de citogenética clássica e molecular associadas com sequenciamento de nova geração. Em seguida, os pontos de junção dos rearranjos foram sequenciados, resultando numa resolução de par de base. Foi observada a ruptura de nove genes nos pontos de quebra de sete pacientes e, em dois casos, foram detectadas fusões gênicas. Sete desses genes tiveram a sua expressão alterada e dois deles puderam ser definidos como a causa do fenótipo dos pacientes. Quatro translocações não romperam genes, sugerindo outros mecanismos patogênicos mais complexos nesses casos. Quatro genes foram considerados como potencialmente afetados por efeito de posição e foi demonstrada a alteração da expressão de um deles. Verificou-se que a junção das extremidades não homólogas foi o mecanismo de formação inferido com maior frequência e que 65% das regiões de pontos de quebra mapeadas afetavam elementos de repetição. Dentre esses casos de rearranjos equilibrados, descrevemos uma paciente com translocação X-autossomo equilibrada, com ruptura da região promotora do gene AMMECR1 no ponto de quebra do cromossomo X, o que ocasionou a ausência de cópias funcionais desse gene. AMMECR1 é um gene de função desconhecida e a consequência clínica de sua perda de função ainda não havia sido descrita. A partir dessa paciente com translocação, e de outros quatro indivíduos do sexo masculino com variantes deletérias envolvendo o AMMECR1, foi observado que a perda de função deste gene acarreta baixa estatura, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, alterações ósseas e cardíacas e perda de audição. A modelagem in vivo por meio de knockdown do ortólogo do AMMECR1 em zebrafish confirmou parte dessa correlação genótipo-fenótipo. Em humanos, a superexpressão do AMMECR1L, um parálogo localizado no cromossomo 2, corresponde a um possível mecanismo de compensação da perda de função do AMMECR1. A proteína AMMECR1 é extremamente conservada ao longo da evolução e apresenta dobras (folds) que potencialmente interagem com ácido nucleico. Além disso, neste estudo foi observado que a proteína AMMECR1 é expressa no núcleo da célula e que a rede de interação desse gene é enriquecida para genes que participam do controle do ciclo celular, sugerindo que a AMMECR1 também exerça um papel nesse processo biológico. Neste estudo, também foi demonstrado que Ammecr1 e Ammecr1l são expressos em tecidos embrionários de camundongo que originam os tipos celulares afetados pelo fenótipo dos pacientes com a perda de função do gene. Para que fosse realizada a quantificação precisa da expressão gênica por RT-qPCR, foi necessário o estudo prévio da estabilidade da expressão de genes de referência comumente usados como controle interno metodológico. De maneira geral, a abordagem metodológica aplicada neste trabalho permitiu a identificação de genes candidatos para o fenótipo dos pacientes com translocações equilibradas, a exploração dos possíveis impactos dos rearranjos na organização da cromatina e a análise de seus mecanismos de formação. Em especial, a descrição das consequências fenotípicas da perda de função do gene AMMECR1 auxiliará no diagnóstico de outros pacientes com doenças genéticas, enquanto que o estudo da função do AMMECR1 levará ao melhor entendimento do controle do ciclo celular. Este trabalho reforça a relevância de se mapear os pontos de quebra de rearranjos cromossômicos equilibrados com alta resolução para a busca de novos genes candidatos para doenças humanas.
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    Estudo da isoforma da enzima conversora de angiotensina I(ECA) de 90kDa, potencial marcador genético da hipertensão: estudo funcional no modelo experimental de transplante renal
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2009-04-29) Leite, Cleber Aparecido [UNIFESP]; Casarini, Dulce Elena [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Post-transplant hypertension is the most important risk factor for kidney disease progression and cardiovascular disease. 80/90 kDa ACE was detected in urine from spontaneous hypertensive rats (SRH) and was described as a possible genetic marker for hypertension. On previous work form our group, we characterized this enzyme in various tissues including heart, liver, adrenal, pancreas, and lung. The aim of this study was to evaluate whether this genetic marker for hypertension migrates from cells present on the graft (kidney from SHR, transplanted to normotensive Wistar rat) to the other tissues, including native kidney (kidney not manipulated from Wistar rat). Wistar rats were transplanted, and received a kidney form SHR (transplant-group) or from themselves (Sham-control group). After surgery, a group of transplanted animals were treated with cyclosporine (CsA, transplant CsA) for 15 and 30 days, and a second group did not receive drug treatment (transplant, no CsA). On 24-hour urine, we analyzed: ACE activity using Z-Phe-His-Leu as substrate and protein expression of ACE isoforms, particularly 80/90 kDa isoform using Western Blotting and the monoclonal antibody 9B9, specific for N-domain terminal. After the end of treatment, animals were sacrificed and tissues were excised to analyze the expression of ACE isoforms by Western Blotting, immunohistochemistry and amino-acid sequencing. In urine from transplantgroup treated with CsA, we detected the 80/90 kDa isoform of ACE, but not in urine form Sham-control group. On tissue evaluation by Western Blotting (native kidney, transplanted kidney, adrenal and lung) it was possible to detect the expression of 80/90 kDa isoform of ACE on transplant-group treated or not with CsA, whereas it was not detected in tissues form Sham-control group. Tissue ACE activity and blood pressure were increased on transplant-group not treated with CsA, as compared with animals treated with CsA and Sham-control group. These results were similar to those from immunohistochemistry where it was shown an intense expression of ACE on the group that did not received CsA treatment. Amino-acid sequencing of the band correspondent to ACE isoform with 80/90 kDa from kidney and lung, showed 75-95% homology with rat, human, mice and bovine ACE. Results suggest that transplanted kidney from SHR to Wistar animals induced the expression of 80/90 kDa ACE isoform both in urine and on analyzed tissues. The amino-acid sequencing of the 80/90 kDa proteic band showed a correspondence with ACE. Blood pressure and ACE activity were increased on native kidney and lungs from transplant-group not treated with CsA, suggesting that kidney transplant from hypertensive to normotensive animals transfers the genetic message, 80/90 kDa ACE, to the different tissues and this could cooperate for the development of hypertension caused by the migration of this molecule, via a phenomenon called microquimerism. The treatment with CsA alters enzymatic activity, and interferes somewhat on physiopathology of hypertension.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Investigação de mecanismos de formação de rearranjos intracromossômicos e sua relação com o fenótipo
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022) Santos, Bruna Ferreira Burssed dos [UNIFESP]; Melaragno, Maria Isabel de Souza Aranha [UNIFESP]; Bellucco, Fernanda Teixeira da Silva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8134165484536116; http://lattes.cnpq.br/0678071850781758; http://lattes.cnpq.br/2188557859308678
    Introdução: As alterações cromossômicas estruturais decorrem de quebras e rearranjos nos cromossomos, podendo alterar a quantidade de material genético presente na célula. Os rearranjos intracromossômicos envolvem apenas um cromossomo, podendo haver inversões, cromossomos em anel e rearranjos intrabraço, como inserções intrabraço e rearranjos do tipo inv dup del, esses caracterizados por uma duplicação invertida associada com uma deleção terminal. Diversos mecanismos têm sido descritos para explicar a formação de rearranjos cromossômicos, dentre eles a Recombinação Homóloga Não-Alélica (NAHR) e a União de Extremidade Não-Homóloga (NHEJ). A análise da sequência do DNA nos pontos de quebra das alterações cromossômicas pode revelar seus mecanismos de formação bem como apontar fatores de risco pois pode expor características relacionadas a mecanismos de reparo do DNA que moldam os rearranjos cromossômicos. Objetivo: Estudar rearranjos cromossômicos raros envolvendo simultaneamente deleções e duplicações intracromossômicas. Métodos: Seis pacientes com duplicações e deleções intracromossômicas foram investigados por meio de cariotipagem, array genômico de catálogo e customizado, hibridação in situ fluorescente (FISH), sequenciamento do genoma completo e sequenciamento de Sanger. Resultados: Três pacientes tiveram seus rearranjos completamente caracterizados e seus pontos de quebra sequenciados. Um deles apresentou um rearranjo mais complexo do que o esperado formado por mecanismo de replicação que resultou na inserção de um fragmento mais distal a um dos pontos de quebra e que deveria estar deletado mas que se encontrava no ponto de junção. Dois deles apresentaram rearranjos do tipo inv dup del com um espaçador entre as duplicações e presença de micro-homologia, sendo proposto o mecanismo Fold-back para suas formações. Outro paciente teve parte de seu rearranjo complexo caracterizado apesar da discordância entre arrays devido à presença de Low Copy Repeats (LCRs). Nos dois pacientes com cromossomo em anel foi revelada a presença de uma duplicação seguida por uma deleção terminal. Conclusões: A realização de diversas técnicas permitiu uma análise detalhada dos diferentes rearranjos dos pacientes, o que possibilitou a inferência de seus possíveis mecanismos de formação e a realização da correlação dos desequilíbrios cromossômicos com os fenótipos dos pacientes.
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    Método para otimização de produção em indústrias de fertilizantes minerais
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-02-21) Martinelli, Renan [UNIFESP]; Mariano, Flávia Cristina Martins Queiroz [UNIFESP]; Martins, Camila Bertini [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3770708843269785; http://lattes.cnpq.br/0360083371873113; http://lattes.cnpq.br/4956707457327572
    A competitividade no âmbito do mercado global é o fator essencial para a sobrevivência de empresas. A tecnologia em inovação e soluções de problemas são cada vez mais utilizada, reduzindo a cada dia trabalhos manuais e intuitivos, pois a dependência desses faz com que as empresas se fragilizem e percam lucratividade. Nas indústrias um dos fatores ligados a eficiência dos setores produtivos é a programação de produção, sendo o sequenciamento da produção um fator chave para evitar perdas de disponibilidade e consequentemente aumentar a produtividade. O sequenciamento de produção visa a redução dos tempos de setup e redução do makespan. Esse tipo de solução é fundamental em empresas que possuem flexibilidade de mix de produtos e que dependem do comparecimento logístico para produção, classificadas como make to order. O objetivo deste trabalho foi propor um método heurístico para otimização do número de setups dos lotes de produção de uma indústria de fertilizantes minerais. O método heurístico foi comparado com o método proposto por Gupta (1988) adaptado, meta-heurística A-BRKGA, modelo matemático fluxo multicommodity e com o método praticado na empresa. Para efeitos de comparação dos ganhos de quantidade de setups entre os métodos, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis e post-hoc de comparações múltiplas de Dunn. Dentre os modelos selecionados, o método heurístico garantiue um ganho econômico para a indústria, devido à redução da quantidade de setups e redução da probabilidade de contaminações entre produtos. Com base nos resultados obtidos com o método heurístico, foi criada e avaliada uma ferramenta de sequenciamento de produção, permitindo que o setor de planejamento e controle de produção e o setor de produção obtenha uma rápida listagem dos lotes a serem produzidos no dia e que garanta uma redução nos custos da empresa.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Uma nova heurística para o problema de minimização de trocas de ferramentas
    (Universidade Federal de São Carlos, 2012-01-01) Chaves, Antonio Augusto [UNIFESP]; Senne, Edson Luiz França; Yanasse, Horacio Hideki [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Universidade Estadual Paulista (UNESP); Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais
    The minimization of tool switches problem (MTSP) seeks a sequence to process a set of jobs so that the number of tool switches required is minimized. This study presents a new heuristic for the MTSP. This heuristic has two phases: a constructive phase, based on a graph where the vertices correspond to tools and there is an arc k = (i, j) linking vertices i and j if and only if the tools i and j are required to execute some job; and an improvement phase, based on an Iterated Local Search. Computational results show that the proposed heuristic has a good performance on the instances tested contributing to a significant reduction in the number of nodes generated by an enumerative algorithm.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Sequenciamento genético em pacientes com sobrecarga de ferro primária
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-06-05) Alvarenga, Aline Morgan [UNIFESP]; Santos, Paulo Caleb Júnior de Lima [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7270343730265469; http://lattes.cnpq.br/2331979070306538
    A hemocromatose é uma doença autossômica recessiva, causada por uma diminuição na concentração de hepcidina ou uma redução na ligação entre hepcidina e ferroportina. A principal variante genética associada à hemocromatose é a p.Cys282Tyr em homozigose no gene HFE. Outras variantes nos genes HJV, HAMP, TFR2, SLC40A1, BMP6 e FTL também têm sido associadas à sobrecarga de ferro. Este projeto possui dois objetivos, sendo o primeiro deles efetuar o sequenciamento, através de metodologia de Sanger, nos éxons dos genes citados, em amostras de pacientes com sobrecarga de ferro cujas causas secundárias foram excluídas e não possuem a variante p.Cys282Tyr em homozigose no gene HFE. O segundo objetivo foi realizar divulgação científica sobre hemocromatose através do Grupo Brasileiro de Hemocromatose (GBH). O sequenciamento dos genes BMP6 e FTL foi realizado e após a análise foram encontradas duas variantes patogênicas e uma variante de significado incerto (VUS) no gene BMP6, sendo que duas delas não foram descritas em literatura. Estes resultados renderam a publicação de um artigo científico. Para o gene FTL foi encontrada uma variante patogênica já descrita e a partir deste resultado foi publicado um case report. O gene HFE foi sequenciado em todos os pacientes, mas não foram obtidos resultados concretos, e devido à falta de financiamento não foi possível sequenciar os demais genes (HJV, HAMP, TFR2 e SLC40A). Além dos artigos citados, também foi publicada uma revisão a respeito da hemocromatose e um trabalho sobre qualidade de vida em pacientes com hemocromatose. A identificação de variantes patogênicas no gene BMP6 e FTL podem contribuir para a compreensão genética da sobrecarga de ferro e projetos no modelo do GBH são de extrema importância para a educação em saúde, contribuindo para a democratização da informação, prevenção da doença e qualidade de vida.