Navegando por Palavras-chave "Plasmodium falciparum"

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    Bioprospecção de Antimaláricos em Extratos de Invertebrados Marinhos
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-02-10) Oliveira, Marcella Izabel Freitas de [UNIFESP]; Azevedo, Mauro Ferreira de; Gozzo, Andrezza Justino [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8319213412361992; http://lattes.cnpq.br/1657599115711431; http://lattes.cnpq.br/2106005923746339; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A malária é uma doença parasitária provocada por cinco protozoários do gênero Plasmodium, em que a espécie Plasmodium falciparum é o causador da forma mais severa da doença, somando aproximadamente 600 mil óbitos por ano. Devido a sua variabilidade genética, o parasita tem adquirido resistência a grande parcela dos medicamentos utilizados no tratamento, ameaçando as populações de toda área tropical e subtropical do planeta. A descoberta de novos medicamentos é essencial para o controle e erradicação. Neste contexto, a bioprospecção atua na identificação de moléculas de interesse produzidas pelo metabolismo de organismos. Este estudo realizou o screening da atividade antiplasmódica de extratos aquosos de invertebrados marinhos provenientes das espécies: Brachidontes sp., Collisella subrugosa, Echinolittorina lineolata, Littorina flava, Morula sp., Palythoa sp., Stramonita brasiliensis e Tetraclita sp., e incluindo frações cromatográficas de L. flava. Uma linhagem transgênica de P. falciparum que expressa a proteína repórter NanoLuc luciferase (Nluc) foi cultivada na presença de uma concentração fixa de cada um dos extratos, simultaneamente a uma cultura de controle de crescimento (sem extrato) e uma cultura com Atovaquona (AV), antimalárico de ação já conhecida. A proliferação dos parasitas foi determinada por bioluminescência. Os extratos e frações com uma atividade inibitória superior ao da AV tiveram determinada a sua concentração que inibe 50% do crescimento da população de parasitas (IC50). A futura realização do ensaio de citotoxicidade em células de mamíferos para determinação do índice de seletividade será importante para guiar sobre quais são os extratos mais promissores para identificação do princípio ativo.
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    Calmidazolium evokes high calcium fluctuations in Plasmodium falciparum
    (Elsevier Science Inc, 2016) Budu, Alexandre [UNIFESP]; Gomes, Mayrim Machado [UNIFESP]; Melo, Pollyana Maria Saud [UNIFESP]; Maluf, Sarah El Chamy [UNIFESP]; Bagnaresi, Piero [UNIFESP]; Azevedo, Mauro Ferreira de; Carmona, Adriana Karaoglanovic [UNIFESP]; Gazarini, Marcos Leoni [UNIFESP]
    Calcium and calmodulin (CaM) are important players in eukaryote cell signaling. In the present study, by using a knockin approach, we demonstrated the expression and localization of CaM in all erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Under extracellular Ca2+-free conditions, calmidazolium (CZ), a potent CaM inhibitor, promoted a transient cytosolic calcium ([Ca2+](cyt)) increase in isolated trophozoites, indicating that CZ mobilizes intracellular sources of calcium. In the same extracellular Ca2+-free conditions, the [Ca2+](cyt) rise elicited by CZ treatment was similar to 3.5 fold higher when the endoplasmic reticulum (ER) calcium store was previously depleted ruling out the mobilization of calcium from the ER by CZ. The effects of the Ca2+/H+ ionophore ionomycin (ION) and the Na+/H+ ionophore monensin (MON) suggest that the [Ca2+](cyt)-increasing effect of CZ is driven by the removal of Ca2+ from at least one Ca2+-CaM-related (CaMR) protein as well as by the mobilization of Ca2+ from intracellular acidic calcium stores. Moreover, we showed that the mitochondrion participates in the sequestration of the cytosolic Ca2+ elicited by CZ. Finally, the modulation of membrane Ca2+ channels by CZ and thapsigargin (THG) was demonstrated. The opened channels were blocked by the unspecific calcium channel blocker Co2+ but not by 2-APB (capacitative calcium entry inhibitor) or nifedipine (L-type Ca2+ channel inhibitor). Taken together, the results suggested that one CaMR protein is an important modulator of calcium signaling and homeostasis during the Plasmodium intraerythrocytic cell cycle, working as a relevant intracellular Ca2+ reservoir in the parasite. (C) 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.
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    Deficiência de piruvato quinase e risco de malária: estudo de base populacional na Amazônia Brasileira
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-09-06) Macedo, Evelyn Gonçalves [UNIFESP]; Ferreira, Marcelo Urbano; Ladeia, Winni Alves; http://lattes.cnpq.br/2164972047087980; http://lattes.cnpq.br/5136161277318799; http://lattes.cnpq.br/2252240863702221
    A suscetibilidade à infecção por estágios sanguíneos dos plasmódios e à malária clínica é modulada por características hereditárias dos hospedeiros que facilitam ou bloqueiam a invasão de glóbulos vermelhos (RBCs) e a multiplicação intracelular de parasitas. Um exemplo é a deficiência de piruvato quinase (PKD), um defeito hereditário de uma enzima eritrocitária decorrente de heterozigosidade composta ou homozigosidade para mutações no gene pklr. A PKD causa anemia hemolítica não esferocítica e limita o crescimento de Plasmodium falciparum nos eritrócitos humanos, mas pode aumentar o risco de malária vivax. Investigamos aqui a associação entre PKD e o risco de malária em nível populacional em uma coorte populacional exposta a P. falciparum e P. vivax. Em primeiro lugar, determinamos a frequência de três polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) representativos (tag SNPs) no gene pklr ou adjacentes – ou seja, rs1052176 (G>T), rs4971072 (A>G) e rs11264359 (A>G) – e o genótipos resultantes e testamos se esses polimorfismos estavam associados ao risco de infecção e doença por P. vivax e P. falciparum em mais de 2.000 participantes de uma coorte de base populacional em Mâncio Lima, Acre, o principal foco de malária urbana do Brasil. Ao todo, foram genotipados 2.043 participantes para rs1052176, 2.045 para rs4971072 e 2.044 para rs11264359. As frequências dos alelos mutantes variaram entre 0,46 e 0,55. Com o uso de modelos de regressão logística de efeitos mistos, testamos se havia associação entre alelos e genótipos de pklr e o risco de monoinfecção por P. vivax ou P. falciparum durante 7 inquéritos transversais realizados entre 2018 e 2021 (cerca de 9.000 observações), com resultados negativos. A heterozigosidade nos loci rs4971072 e rs11264359 pareceu conferir proteção contra a malária clínica (qualquer espécie) em modelos logísticos parcialmente ajustados, mas a significância estatística de tal associação desapareceu após o ajuste para outro polimorfismo de “resistência à malária”, a substituição T>C no motivo de ligação ao fator de transcrição GATA1 específico para eritrócitos, que elimina a expressão de DARC em hemácias, levando ao fenótipo Duffy-negativo. A seguir, investigamos a associação entre os três SNPs representativos e a atividade PK em hemácias. Para tanto, utilizamos hemácias recém-colhidas tratadas com EDTA em um ensaio colorimétrico padrão. A atividade enzimática de PK foi maior em hemácias de 77 participantes com a sequência de tipo selvagem em todos os SNPs (genótipo GG/AA/AA), com uma média de 7,45 U/g de hemoglobina, em comparação com 74 participantes com mutações em todos os SNPs (genótipo TT/GG/GG), com uma média de 6,58 U/g de hemoglobina. No entanto, encontramos taxas de prevalência semelhantes de PKD entre participantes com o genótipo de tipo selvagem GG/AA/AA (7 de 77, 9,1%) e aqueles com o genótipo mutado TT/GG/GG (7 de 74, 9,5%), sugerindo que os polimorfismos nos três loci analisados não eram capazes de predizer PKD nesta população. Concluímos que os SNPs representativos do gene pklr ou adjacentes são frequentemente encontrados nesta população exposta à malária, mas não estão associados à redução do risco de malária e nem são preditivos de PKD.
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    Descoberta de novos compostos derivados de cloroquina como candidatos a antimaláricos
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-03-21) Peres, Erica Paloma Maso Lopes [UNIFESP]; Aguiar, Anna Caroline Campos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6217232206685846; https://lattes.cnpq.br/2241425834402728; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introdução: A malária é uma doença tropical grave, caracterizada por sua alta taxa de mortalidade e morbidade, representando um significativo problema de saúde pública com impacto socioeconômico. O controle da malária enfrenta desafios devido dificuldade no combate ao vetor e à rápida disseminação de linhagens de parasitos resistentes aos antimaláricos convencionais. O surgimento de resistência compromete a eficácia dos tratamentos atuais, tornando a luta contra a malária um desafio cada vez mais complexo sendo de extrema importância a busca por novos candidatos a antimaláricos potentes, de baixo custo e não tóxico ao hospedeiro vertebrado. Objetivo: Avaliar a atividade antiplasmodial e o alvo de ação contra estágios assexuados sanguíneos de 8 novos análogos de cloroquina, utilizando cepa de Plasmodium falciparum sensível e resistentes. Métodos: Realizamos ensaios in vitro para determinar o IC50 dos novos compostos contra as cepas de P. falciparum 3D7 (sensível), Dd2, K1 e SB1 (resistentes), utilizando o ensaio de SBYR Green I. Em seguida, prosseguimos com a avaliação citotóxica, a partir do método de rezarsurina, utilizando linhagens celulares de hepatoma humano (HepG2) e rim embrionário (HEK-293). Após essa fase, examinamos o mecanismo de resistência dos novos análogos de CQ na presença do verapamil, um inibidor de bombas de efluxo de P. falciparum e que está relacionada a resistência aos antimaláricos. Posteriormente, identificamos o vacúolo digestivo de P. falciparum como alvo intracelular dos novos compostos, utilizamos o marcador fluorescente Acridina Orange (AO). Em sequência, selecionamos os compostos 1, 2, 6 e 7 e realizamos ensaios ex vivo contra isolados de campo com P. falciparum e P. vivax circulantes na região amazônica brasileira. Resultados: Os compostos 6 e CEQ foram os mais potentes in vitro, apresentando IC50 de 7 nM e 15 nM, respectivamente, contra a cepa 3D7. Frente às cepas resistentes, os compostos mais potentes foram CEQ e 1 (cepa Dd2) com o IC50 de 30 nM e 75 nM, respectivamente, para a cepa K1, os compostos mais potentes foram 5, 7 e 8 com IC50 de 33 nM à 81 nM e para a cepa SB1 os compostos testados foram 1, 2 e 3 e todos se mostraram potentes com IC50 variando de 10 nM a 89 nM. A resistência cruzada dos compostos foi avaliada comparando seus valores de IC50 tanto para cepa sensível quanto resistentes à cloroquina. Os compostos 1, 2, 5, 7 e 8, não apresentaram índice de resistência cruzada (IRC) nos ensaios in vitro com valores de IRC <5. Os compostos CEQ, 3, 4 e 6 apresentaram IRC moderada a alta com valores de IRC >5. No ensaio com verapamil os compostos testados foram 1, 2, 3, 4 e 6 e foi observado uma redução do IC50, após incubação com verapamil, sugerindo resistência frente a cepa Dd2. Os compostos não se mostraram tóxicos para as células HepG2 e HEK-293. Para os ensaios de identificação do vacúolo digestivo (VD) com o marcador AO, pudemos identificar que ouve interação dos compostos com esta organela á partir da alteração da homeostase iônica, assim como observado para a CQ. Quando avaliamos a potência dos compostos frente aos isolados de campo circulantes em Porto Velho, foi possível observar que estes compostos foram mais potentes contra o P. vivax quando comparado com o P. falciparum, indicando uma baixa sensibilidade a essa espécie. Conclusão: Podemos concluir que esta nova classe de análogos de cloroquina apresentou resultados promissores in vitro, no entanto, não foram ativos contra os isolados circulantes na Amazônia brasileira de P. falciparum.
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    Estudo da atividade proteolitica e inibicao de peptidases do Plasmodium falciparum e Plasmodium chabaudi
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2012) Melo, Pollyana Maria Saud [UNIFESP]
    A malaria e uma doenca parasitaria que afeta milhoes de pessoas todos os anos, segundo a Organizacao Mundial de Saúde. Alem de ser uma doenca responsavel por altos indices de morbidade e mortalidade, e tambem um problema socioeconomico mundial, sendo que 50% da populacao mundial esta sobre risco de contrair a infeccao. O parasita em seu complexo ciclo de vida passa por um hospedeiro invertebrado e um hospedeiro vertebrado. Neste ultimo, o seu ciclo intra-eritrocitico leva ao desequilibrio do seu hospedeiro, alterando a hemodinamica, a coagulacao e o sistema inflamatorio. A analise do genoma de Plasmodium falciparum permitiu a identificacao de 90 diferentes proteases que estao envolvidas em inumeros processos como degradacao da hemoglobina, invasao e egresso dos eritrocitos. Apesar de se conhecer bem o envolvimento destas enzimas neste processo de degradacao o papel dessas proteases na degradacao de outras proteinas do hospedeiro e pouco explorado. Uma possivel funcao destas enzimas e atuar com o hospedeiro na tentativa de minimizar o desequilibrio gerado pela infeccao e aumentar a sobrevivencia do parasita. Dentre as proteinas plasmaticas, o plasminogenio participa nos processos de coagulacao, angiogenese e inflamacao, a partir da geracao de plasmina e angiostatina resultantes da hidrolise por diversas proteases ou ativadores do plasminogenio. Este novo aspecto sobre a interacao parasita-hospedeiro e um dos objetos de estudo da presente tese. Usando diferentes metodos bioquimicos observamos que o plasminogenio e hidrolisado por P.falciparum, P. chabaudi e falcipainas recombinantes (cisteino - proteases do P. falciparum). O processamento de plasminogenio pelos parasitas gerou peptideos angiostaticos que inibiram a angiogenese e foram capazes de aumentar a concentracao de calcio citoplasmatico em celulas endoteliais umbilicais humanas (HUVEC), funcoes previamente descritas para a angiostatina. Ainda na presente tese estudamos a acao inibitoria das cistatinas recombinantes de cana-de-acucar (canacitatinas CaneCPI-1, CaneCPI-2, CaneCPI-3, CaneCPI-4 e CaneCPI-4 TAT) sobre as cisteino-proteases do Plasmodium. Estas cistatinas foram testadas como possiveis candidatas a novas drogas, com a capacidade de inibir as cisteino-proteases do parasita
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    Investigação das moléculas envolvidas na permeabilização das membranas e na regulação do processo de egresso de plasmodium falciparum na hemácia infectada
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2019-07-31) Melo, Hamille Rocha [UNIFESP]; Azevedo, Mauro Ferreira de [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1657599115711431; http://lattes.cnpq.br/6091182573007243; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introduction: In spite of the recent advances towards its control, malaria is still a burden to society, killing mainly children under five years of age. While successful treatment with total cure is available, drug resistance threatens patients care in the future and therefore, new antimalarial medicines are required. A potential target for chemotherapeutic intervention is host cell egress, a tightly regulated process that happens after parasites grow and multiply inside the human erythrocytes. Parasite enzymes are known to act in concert dismantling parasitophorous vacuole (PV) and red blood cell (RBC) membranes, but the hierarchy of their action is not completely understood. Objectives: The aims of this study were to establish a method that can be applied to identify compounds that affect egress and to investigate the sequence of the biochemical events involved. Methods: In order to synchronize parasites in two key moments that precede egress, P. falciparum 3D7 parasites were engineered to express endogenous calcium dependent protein kinase 5 (CDPK5) or protein kinase G (PKG) in fusion with a destabilization domain (DD). Expression of each DD tagged kinase is dependent on the ligand Shld-1 and its removal reversibly block egress. Expression of the sensitive reporter nanoluc (NLuc) either secreted do the PV or exported to the RBC was applied to quantify egress. Results: As expected, removal of Shld-1 nearly completely blocked egress in both transgenic lines and when Shld-1 was reintroduced to cultures previously synchronized with sorbitol and heparin at 4548 hours post invasion, Nluc activity in the supernatant increased in CDPK5-DD and PKG-DD cultures after 1 and 2 hours respectively. Microscopic and FACS analysis confirmed the increase in reporter activity correlated to egress. About a couple dozen compounds were evaluated. Egress of CDPK5-DD and PKG-DD were affected differently by a few compounds, demonstrating the method can be applied identify parasite enzymes and/or signalling pathways that act after PKG and before CDPK5. Conclusion: Remarkably, data provided by this study suggest a calpain and a few kinases such as PKA act temporally between PKG and CDPK5. Application of this protocol might allow the identification of many more compounds that affect egress and elucidating when their targets are required respectively to PKG and CDPK5 activation.
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    KBE009: An antimalarial bestatin-like inhibitor of the Plasmodium falciparum M1 aminopeptidase discovered in an Ugi multicomponent reaction-derived peptidomimetic library
    (Pergamon-Elsevier Science Ltd, 2017) Gonzalez-Bacerio, Jorge; Maluf, Sarah El Chamy [UNIFESP]; Mendez, Yanira; Pascual, Isel; Florent, Isabelle; Melo, Pollyana Maria Saud [UNIFESP]; Budu, Alexandre [UNIFESP]; Ferreira, Juliana Conrado [UNIFESP]; Moreno, Ernesto; Carmona, Adriana Karaoglanovic [UNIFESP]; Rivera, Daniel G.; Rivero, Maday Alonso del; Gazarini, Marcos Leoni [UNIFESP]
    Malaria is a global human parasitic disease mainly caused by the protozoon Plasmodium falciparum. Increased parasite resistance to current drugs determines the relevance of finding new treatments against new targets. A novel target is the M1 alanyl-aminopeptidase from P. falciparum (PfA-M1), which is essential for parasite development in human erythrocytes and is inhibited by the pseudo-peptide bestatin. In this work, we used a combinatorial multicomponent approach to produce a library of peptidomimetics and screened it for the inhibition of recombinant PfA-M1 (rPfA-M1) and the in vitro growth of P. falciparum erythrocytic stages (3D7 and FcB1 strains). Dose-response studies with selected compounds allowed identifying the bestatin-based peptidomimetic KBE009 as a submicromolar rPfA-M1 inhibitor (K-i = 0.4 mu M) and an in vitro antimalarial compound as potent as bestatin (IC50 = 18 mu M
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    A modified fluorescence in situ hybridization protocol for Plasmodium falciparum greatly improves nuclear architecture conservation
    (Elsevier B.V., 2010-09-01) Contreras-Dominguez, Monica; Moraes, Carolina Borsoi [UNIFESP]; Dorval, Thierry; Genovesio, Auguste; Dossin, Fernando de Macedo; Freitas-Junior, Lucio H.; Inst Pasteur Korea; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Fluorescence in situ hybridization (FISH) has been used extensively in the study of nuclear organization and gene positioning in Plasmodium falciparum. While performing FISH with published protocols, we observed large variations in parasite nuclear morphology. We hypothesized that these inconsistencies might be due to the type of parasite preparation prior to FISH, which commonly involves air-drying, prompting us to develop a new fixation protocol. Here we show both qualitatively and quantitatively that compared to air-dried and briefly fixed parasites, longer fixation in suspension leads to improved conservation of nuclear structure and lower intra-population variation of nuclear shape as well as area after FISH development. While the fixation protocol per se does not cause detectable disruptions in nuclear morphology, it greatly influences the conservation of nuclear shape and size during the most stringent steps of FISH. the type of fixation used also influences the detection of telomeric clusters, and we show that the new fixation protocol permits improved conservation of the chromosome end cluster perinuclear distribution and higher colocalization indexes for two adjacent chromosome end probes, Rep20 and telomere. Overall, the results indicate that our alternative protocol dramatically improves conservation of the nuclear architecture compared to previously reported Plasmodium DNA-FISH protocols and highlights the necessity of carefully choosing the fixation protocol for FISH. (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.
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    Acesso aberto (Open Access)
    A multifunctional serine protease primes the malaria parasite for red blood cell invasion
    (Nature Publishing Group, 2009-03-18) Koussis, Konstantinos; Withers-Martinez, Chrislaine; Yeoh, Sharon; Child, Matthew; Hackett, Fiona; Knuepfer, Ellen; Juliano, Luiz [UNIFESP]; Woehlbier, Ute; Bujard, Hermann; Blackman, Michael J.; Natl Inst Med Res; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Univ Heidelberg
    The malaria parasite Plasmodium falciparum replicates within an intraerythrocytic parasitophorous vacuole (PV). Rupture of the host cell allows release (egress) of daughter merozoites, which invade fresh erythrocytes. We previously showed that a subtilisin-like protease called PfSUB1 regulates egress by being discharged into the PV in the final stages of merozoite development to proteolytically modify the SERA family of papain-like proteins. Here, we report that PfSUB1 has a further role in 'priming' the merozoite prior to invasion. the major protein complex on the merozoite surface comprises three proteins called merozoite surface protein 1 (MSP1), MSP6 and MSP7. We show that just before egress, all undergo proteolytic maturation by PfSUB1. Inhibition of PfSUB1 activity results in the accumulation of unprocessed MSPs on the merozoite surface, and erythrocyte invasion is significantly reduced. We propose that PfSUB1 is a multifunctional processing protease with an essential role in both egress of the malaria merozoite and remodelling of its surface in preparation for erythrocyte invasion.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Organização espacial da transcrição como um potencial mecanismo de expressão gênica em Plasmodium falciparum
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2009) Moraes, Carolina Borsoi [UNIFESP]; Silveira, Jose Franco da [UNIFESP]
    Crescentes evidências mostram que a organização espacial da transcrição é um fator epigenético importante na regulação gênica em eucariotos. Em células de mamíferos, os genes são transcritos em estruturas nucleares discretas conhecidas como fábricas de transcrição, e genes com funções relacionadas e co-regulados compartilham as mesmas fábricas de transcrição. Plasmodium falciparum apresenta um padrão de expressão gênica bastante complexo durante o ciclo eritrocítico, contrastando paradoxalmente com o baixo número de putativos fatores de transcrição codificados pelo seu genoma. Por outro lado, mecanismos epigenéticos são importantes na regulação gênica neste parasita. Nesta tese, investigamos a organização da transcrição em P. falciparum visando determinar se a organização nuclear está relacionada com a expressão/regulação gênica ao longo do desenvolvimento do parasita. Com este objetivo, marcamos transcritos nascentes com BrUTP em formas eritrocíticas de P. falciparum. Assim como em mamíferos, a transcrição no parasita também está organizada em focos nucleoplásmicos discretos, chamados fábricas de transcrição. Análises automatizadas de imagens em 3D mostram que o número e a intensidade das fábricas de transcrição variam durante o ciclo eritrocítico, estando correlacionados com o número de genes expressos em cada estágio, mas não com o volume nuclear. O baixo número de fábricas indica que os genes ativos compartilham as fábricas enquanto estão sendo transcritos. Surpreendentemente, as fábricas são espacilamente redistribuídas durante o desenvolvimento de anéis para trofozoítas, com a periferia nuclear sendo a zona de transcrição favorita nos anéis, enquanto nos trofozoítas as fábricas estão igualmente distribuídas por todo o nucleoplasma. Também observamos que a transcrição por RNA polimerase I ocorre principalmente nas áreas centrais dos núcleos em trofozoítas, sugerindo que os componentes nucleolares podem ser dispersos devido à entrada na fase S. Assim como nos eucariotos superiores, as fábricas de transcrição em P. falciparum também se localizam em áreas nucleares com baixa densidade de cromatina. Análises de imunofluorescência combinando incorporação de BrUTP com marcadores nucleares mostram que as fábricas de transcrição formam um compartimento exclusivo, diferente do compartimento de silenciamento definido por PfSir2A ou do compartimento de cromatina ativa definido por H4ac ou H3K79me3. Para estudar a organização espacial da cromatina e entender como os genes co-regulados interagem com as fábricas de transcrição, decidimos realizar ensaios de hibridização fluorescente in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH). Durante a realização de ensaios de FISH seguindo protocolos publicados, observamos uma grande variação na morfologia nuclear dos parasitas, o que nos moveu a otimizar esta técnica. Utilizando análises automatizadas de imagens, mostramos que os parasitas desidratados por secagem ao ar e fixados por curtos períodos de tempo à temperatura ambiente apresentam uma variação intra-populacional maior em relação à forma e ao volume nucleares após o ensaio de FISH, assim como valores de volume quase duas vezes maiores, do que núcleos de parasitas fixados em suspensão por longos períodos de tempo e em baixas temperaturas. Também observamos que a fixação em suspensão leva a uma melhor conservação da estrutura nuclear, e índices de colocalização mais altos para duas sondas de repetições adjacentes das extremidades cromossômicas, Rep20 e telômeros. Em resumo, nossos resultados mostram que o tipo de protocolo de fixação utilizado antes da realização do desenvolvimento de FISH é um fator crucial para a conservação apropriada da arquitetura nuclear.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Plasmodium falciparum in the southeastern Atlantic forest: a challenge to the bromeliad-malaria paradigm?
    (Biomed Central Ltd, 2015-04-25) Laporta, Gabriel Zorello; Burattini, Marcelo Nascimento [UNIFESP]; Levy, Debora; Fukuya, Linah Akemi; Porangaba de Oliveira, Tatiane Marques; Maselli, Luciana Morganti Ferreira; Conn, Jan Evelyn; Massad, Eduardo; Bydlowski, Sergio Paulo; Sallum, Maria Anice Mureb; Universidade de São Paulo (USP); Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Wadsworth Ctr; SUNY Albany
    Background: Recently an unexpectedly high prevalence of Plasmodium falciparum was found in asymptomatic blood donors living in the southeastern Brazilian Atlantic forest. the bromeliad-malaria paradigm assumes that transmission of Plasmodium vivax and Plasmodium malariae involves species of the subgenus Kerteszia of Anopheles and only a few cases of Plasmodium vivax malaria are reported annually in this region. the expectations of this paradigm are a low prevalence of Plasmodium vivax and a null prevalence of Plasmodium falciparum. Therefore, the aim of this study was to verify if Plasmodium falciparum is actively circulating in the southeastern Brazilian Atlantic forest remains.Methods: in this study, anophelines were collected with Shannon and CDC-light traps in seven distinct Atlantic forest landscapes over a 4-month period. Field-collected Anopheles mosquitoes were tested by real-time PCR assay in pools of ten, and then each mosquito from every positive pool, separately for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax. Genomic DNA of Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax from positive anophelines was then amplified by traditional PCR for sequencing of the 18S ribosomal DNA to confirm Plasmodium species. Binomial probabilities were calculated to identify non-random results of the Plasmodium falciparum-infected anopheline findings.Results: the overall proportion of anophelines naturally infected with Plasmodium falciparum was 4.4% (21/480) and only 0.8% (4/480) with Plasmodium vivax. All of the infected mosquitoes were found in intermixed natural and human-modified environments and most were Anopheles cruzii (22/25 = 88%, 18 Plasmodium falciparum plus 4 Plasmodium vivax). Plasmodium falciparum was confirmed by sequencing in 76% (16/21) of positive mosquitoes, whereas Plasmodium vivax was confirmed in only 25% (1/4). Binomial probabilities suggest that Plasmodium falciparum actively circulates throughout the region and that there may be a threshold of the forested over human-modified environment ratio upon which the proportion of Plasmodium falciparum-infected anophelines increases significantly.Conclusions: These results show that Plasmodium falciparum actively circulates, in higher proportion than Plasmodium vivax, among Anopheles mosquitoes of fragments of the southeastern Brazilian Atlantic forest. This finding challenges the classical bromeliad-malaria paradigm, which considers Plasmodium vivax circulation as the driver for the dynamics of residual malaria transmission in this region.
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    The role of melatonin in parasite biology
    (Elsevier B.V., 2012-01-01) Bagnaresi, Piero [UNIFESP]; Nakabashi, Myna; Thomas, Andrew P.; Reiter, Russel J.; Garcia, Celia R. S.; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Universidade de São Paulo (USP); UMDNJ; Univ Texas Hlth Sci Ctr San Antonio
    Regarded as the circadian hormone in mammals, melatonin is a highly conserved molecule, present in nearly all species. in this review, we discuss the role of this indolamine and its precursors in the cell biology of parasites and the role of the molecule in the physiology of the host. in Plasmodium, melatonin can modulate intracellular concentrations of calcium and CAMP, which in turn can regulate kinase activity and cell cycle. in Trypanosoma infections, modulation of the immune system by melatonin is extremely important in controlling the parasite population. Melatonin also contributes to the inflammatory response to Toxoplasma gondii infection. Thus, there are a number of unique adaptations involving intricate connections between melatonin and the biology of the parasite-host relationship. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.
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    Strategies for Development of Antimalarials Based on Encapsulated Porphyrin Derivatives
    (Bentham Science Publ Ltd, 2014-01-01) Deda, Daiana Kotra; Budu, Alexandre [UNIFESP]; Cruz, Laura Nogueira; Araki, Koiti; Garcia, Celia Regina da Silva; Universidade de São Paulo (USP); Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Despite the efforts in controlling the parasite and infection, and the significant progress achieved in recent years in its treatment, malaria is still prevalent in many regions and out of control in others. The repertoire of alternatives to fight malaria is being expanded, not only by designing new drugs but also by developing improved drug delivery systems able to enhance the antimalarial efficiency of conventional and new drugs. Among the new drugs that have been investigated, several publications report the use of porphyrin derivatives as antimalarials but their efficiency is contradictory. The low activity of porphyrins seems to be associated with low dispersibility and bioavailability. In this respect, Nanotechnology can provide efficient solutions to enhance bioavailability and delivery of conventional and new antimalarials, in order to assure high enough efficiency levels to inactivate the parasite. Thus, in this review we highlight the use of drug delivery systems for conventional and new antimalarials and we propose the encapsulation of porphyrins as a promising alternative for development of anti-malarial formulations.
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    Substrate specificity studies of the cysteine peptidases falcipain-2 and falcipain-3 from Plasmodium falciparum and demonstration of their kininogenase activity
    (Elsevier B.V., 2013-02-01) Cotrin, Simone Silva [UNIFESP]; Gouvea, Iuri Estrada [UNIFESP]; Melo, Pollyana Maria Saud [UNIFESP]; Bagnaresi, Piero [UNIFESP]; Assis, Diego Magno [UNIFESP]; Araujo, Mariana da Silva [UNIFESP]; Juliano, Maria Aparecida [UNIFESP]; Gazarini, Marcos Leoni [UNIFESP]; Rosenthal, Philip J.; Juliano, Luiz [UNIFESP]; Carmona, Adriana Karaoglanovic [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Univ Calif San Francisco
    We studied the substrate specificity requirements of recombinant cysteine peptidases from Plasmodium falciparum, falcipain-2 (FP-2) and falcipain-3 (FP-3), using fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptides as substrates. Systematic modifications were introduced in the lead sequence Abz-KLRSSKQ-EDDnp (Abz = ortho-aminobenzoic acid; EDDnp = N-[2,4-dinitrophenyl]ethylenediamine) resulting in five series assayed to map S-3 - S-2' subsite specificity. Despite high sequence identity and structural similarity between FP-2 and FP-3, noteworthy differences in substrate specificity were observed. the S-1 subsite of FP-2 preferentially accommodates peptides containing the positively charged residue Arg in P-1, while FP-3 has a clear preference for the hydrophobic residue Leu in this position. the S-2 subsite of FP-2 and FP-3 presents a strict specificity for hydrophobic residues, with Leu being the residue preferred by both enzymes. FP-2 did not show preference for the residues present at P-3, while FP-3 hydrolysed the peptide Abz-ALRSSRQ-EDDnp, containing Ala at P-3, with the highest catalytic efficiency of all series studied. FP-2 has high susceptibility for substrates containing hydrophobic residues in P-1', while FP-3 accommodates well peptides containing Arg in this position. the S-2' subsite of both enzymes demonstrated broad specificity. in addition, radioimmunoassay experiments indicated that kinins can be generated by FP-2 and FP-3 proteolysis of high molecular weight kininogen (HK). Both enzymes excised Met-Lys-bradykinin, Lys-bradykinin and bradykinin from the fluorogenic peptide Abz-MISLMKRPPGFSPFRSSRI-NH2, which corresponds to the Met(375) to Ile(393) sequence of HK. the capability of FP-2 and FP-3 to release kinins suggests the involvement of these enzymes in the modulation of malaria pathophysiology. (c) 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.