Navegando por Palavras-chave "Metaloproteases"

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    Acao proteolitica da hementerina-metaloprotease da sanguessuga haementeria depressa-sobre fibrinogenio e fibrina
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1997) Rosa-Pasetti, Ana Paula de Paula [UNIFESP]
    No complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa foi encontrada uma enzima fibrin(ogeno) litica denominada hementerina (Kelen & Rosenfel - 1975). Esta foi purificada ate sua homgeneidade, por cromatografia de gel filtracao, cromatografia de troca ionica e eletroforese preparativa. A hementerina e uma enzima de cadeia unica com massa molecular de 80 kDa, calcio dependente, resistente a EACA e Trasylol e inibida por EDTA, sendo classificada como uma metaloprotease. A hementerina degrada especificamente fibrinogenio (Fg) por um caminho independente de plasminogenio e possui atividade anti-agregante plaquetaria. A ordem de clivagem na molecula de fibrinogenio, induzida por esta enzima, inicia-se na cadeia A, , e mais lentamente, B, diferenciando-a, assim, das outras fibrinogenases conhecidas. Fragmentos de fibrina ocross-linkedo e nao ocross-linkedo foram reconhecidos por anticorpos monoclonais dirigidos contra o fragmento E (de plasmina), bem como por anticorpos policlonais anti-fibrinogenio. Epitopos de cadeia gama recohecidos por anticorpos anti-D-dimero nao foram revelados. A menterina e portanto uma metaloprotease fibrin(ogeno)litica que origina fragmentos diferentes daqueles induzidos por plasmina e por outras fibrinogenases, assemelhando-se a hementina, outra fibrinogenase isolada da sanguessuga Haementeria ghilianii, e que por sua propriedade de degradar rapida e especificamente o fibrinogenio e capaz de impedir eficientemente inclusive a agregacao plaquetaria induzida por colageno, ADP e trombina, revelando assim ser um potente agente anticoagulante e fibrinolitico. Baseado nos resultados, pode-se concluir que a hementerina possui acao anticoagulante e e capaz de destruir coagulos de fibrina e tambem impedir a agregacao plaquetaria
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    Acesso aberto (Open Access)
    Além da atividade proteolítica das metaloproteases: atividade imunomoduladora da Thimet oligopeptidase (TOP) no tratamento do melanoma murino B16F10Nex2
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-02-28) De Amat Herbozo, Carolina Cecilia [UNIFESP]; Rodrigues, Elaine Guadelupe [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6913514130496062; http://lattes.cnpq.br/9647501450376151; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Previous studies in our laboratory have shown that two bacterial metalloproteases, oligopeptidase A (OpdA) and arazyme, have antitumor activity. This property was independent of their proteolytic activity, and it was mediated by an immunomodulatory effect, involving the activation of antigen presenting cells (APCs). Those results could indicate that OpdA and arazyme were recognized by APCs because of their bacterial origin or otherwise, the immunomodulatory ability was a characteristic of metalloproteases in general, regardless of their origin. The aim of the present study was to evaluate the immunomodulatory and antitumor activity of thimet oligopeptidase (TOP), a murine metallopeptidase, in the B16F10-Nex2 murine melanoma model. Expression and purification of the recombinant version of TOP (rTOP) were optimized, and active and heat-inactivated forms were analyzed. rTOP did not show direct cytotoxic activity in vitro on tumor cells. In vivo assays showed that rTOP has a dose-dependent antitumor activity only in the metastatic, but not in the subcutaneous model. The antitumor effect was independent of the rTOP proteolytic activity, and dependent on a functional adaptive immune response, since it was abolished in immunodeficient animals. Cytokine analysis of serum samples and ex vivo restimulated spleen and lymph node cells revealed that a tumor-specific Th1 response was favored in rTOP treated animals. The active form of the metalloprotease stimulated an increase of IFN-γ, whereas the heat-inactivated form inhibited IL-10 production. Murine bone marrow-derived macrophages and dendritic cells (BMDMs and BMDCs, respectively), were activated in the presence of both active and inactive rTOP, resulting in increased NO production, IL-12p40, TNF-α and IL-10 secretion, and expression of the costimulatory molecules CD80, CD86 and CD40 in BMDCs. Assays in the presence of polymyxin B and with proteinase K-degraded metaloprotease demonstrated that the immunomodulatory activity of rTOP on APCs is not due to the residual LPS of the recombinant preparation. Assays with cells obtained from knockout mice or using specific antagonists/inhibitors determined that the activation of BMDCs is dependent on the presence and function of the TLR4 receptor and the MyD88 and TRIF adapters, and participation of the JNK, p38 and MAP/ERK kinases. In addition, the MyD88 pathway was essential for the antitumor effect of rTOP in the metastatic melanoma model in vivo. In conclusion, rTOP exhibits antitumor activity in the murine metastatic melanoma model mediated by an immunomodulatory effect, and the activation of APCs by rTOP requires the same receptor and signaling pathways as the bacterial metalloproteases studied before.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Avaliação de glicosaminoglicanos e proteínas de matriz extracelular em queratinócitos submetidos ao estresse oxidativo e ao choque hiperosmótico.
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2013) Leme Júnior, Luiz Eugênio Garcez [UNIFESP]; Justo, Giselle Zenker [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9147445236159161; http://lattes.cnpq.br/0632935026262183; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A pele e o maior orgao do corpo, atuando como uma barreira contra a radiacao e patogenos, mantendo a temperatura corporal, prevenindo contra desidratacao e funcionando como orgao sensorial. Os glicosaminoglicanos (GAGs) tem importantes funcoes nas celulas da pele, tais como a participacao no controle da proliferacao e divisao celular, comunicacao e adesao celular e modulacao das respostas celulares aos estimulos externos. O estresse oxidativo e o choque hiperosmotico sao os tipos de estresses que mais afetam os queratinocitos da pele. Este trabalho avaliou os efeitos do estresse oxidativo, induzido pelo peroxido de hidrogenio (H2O2) e do choque hiperosmotico, induzido pelo sorbitol, sobre o perfil de GAGs e sobre a expressao genica e/ou proteica de sindecans e enzimas associadas ao metabolismo dessas moleculas em queratinocitos humanos da linhagem HaCaT. Proteoglicanos (PGs) foram metabolicamente marcados com [35S]-sulfato apos exposicao das celulas a 1,2 (IC25) e 2,0 mM (IC50) de H2O2 por 4 h (estresse oxidativo) e 0,4 (IC25) e 1,0 M (IC50) de sorbitol por 2 h (choque hiperosmotico). A seguir, os GAGs foram identificados pela diGestão com enzimas especificas. Os resultados demonstraram que celulas HaCaT sintetizam e secretam heparam sulfato (HS), acido hialuronico (AH) e um hibrido de condroitim sulfato e dermatam sulfato (CS/DS). O estresse oxidativo induzido por 2,0 mM de H2O2 (IC50) causou um aumento significativo na sintese de GAGs sulfatados ao mesmo tempo que provocou uma diminuicao na sintese e secrecao de AH. O tratamento com 1,2 mM de H2O2 (IC25) diminuiu a sintese e secrecao de AH, sem causar alteracoes no perfil de GAGs sulfatados. O choque hiperosmotico induzido pelo tratamento com sorbitol nas concentracoes de 0,4 M (IC25) e 1,0 M (IC50) provocou diminuicao na sintese e secrecao de GAGs sulfatados e aumento na concentracao de AH. Os niveis de expressao de genes relacionados ao metabolismo de proteoglicanos de HS (HPSE1, SDC1 e SDC4), genes relacionados ao metabolismo do AH (HAS2, HAS3, HYAL1 e HYAL2) e genes codificantes de gelatinases e seus inibidores (MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP2 e RECK), analisados por qPCR, diminuiram significativamente tanto apos o estresse oxidativo como apos o choque hiperosmotico nas duas concentracoes estudadas. Uma diminuicao na expressao de HYAL3 foi observada em celulas expostas ao estresse oxidativo causado pela concentracao de H2O2 referente ao IC50. O gene HAS1 nao e expresso em celulas HaCaT. As concentracoes das proteinas HYAL1 e HYAL2, avaliadas por western blotting, aumentaram significativamente apos exposicao ao H2O2 e ao sorbitol nas concentracoes equivalentes aos valores de IC50. Esse aumento nas concentracoes de HYAL1 e HYAL2, juntamente com a degradacao quimica causada pelo H2O2, pode explicar a diminuicao observada nos niveis de AH apos o estresse oxidativo. A atividade da proteina HPSE1 nao variou nos tratamentos estudados, sugerindo que outros fatores contribuem para os niveis reduzidos de HS induzidos pelo choque hiperosmotico
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    Acesso aberto (Open Access)
    Avaliação do potencial condroprotetor da molécula rLosac em modelo inflamatório, in vitro, induzido pela interleucina 1β
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-12-30) Pereira Junior, Edgard dos Santos [UNIFESP]; Cohen, Moises [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6174355233304675; http://lattes.cnpq.br/3187999559985229; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Background: Osteoarthritis is an articular disease more prevalent, resulting in the progressive deterioration of the articular cartilage, mediated by proinflammatory pathways of the innate immunity and the production of cytokines. The use of chondroprotective drugs can slow the process of deterioration joint although its effectiveness is questionable. rLosac is a cytoprotective adhesion molecule from the caterpillar Lonomia obliqua. Purpose: To evaluate the chondroprotective potential of rLosac in fibrochondrocytes. Methods: The primary culture of fibrochondrocytes were obtained from rat knee meniscus, grown in two conditions: serum deprivation or in the presence os 10ng/mL interleukin 1β and then treated with rLosac. Various parameters were measured: cell viability, cell cycle and apoptosis by flow cytometry, release of nitric oxide, and protein expression of extracellular matrix molecules. Results: rLosac was able to increase proliferation of fibrochondrocytes and to inhibit apoptosis induced by serum deprivation. In the presence of 10 ng/mL IL-1β, rLosac caused reduction of nitric oxide release and matrix metalloproteinases 2 and 9 activities, and preservation of the extracellular matrix components such as type II collagen, fibronectin and laminin. Conclusions: rLosac is able to induce cell proliferation in fibrochondrocytes and to prevent cell death induced by serum deprivation or in the presence of interleukin 1β, modulating cell cycle and increasing cell survival, reducing nitric oxide release and the activity of metalloproteinases 2 and 9, besides to preserve extra cellular matrix
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    Caracterizacao dos efeitos promovidos pela peconha da serpente Bothrops jararaca no ducto deferente de rato
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2008) Sciani, Juliana Mozer [UNIFESP]
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    Diversidade funcional das metaloproteases de classe PI insularinase e brazilase, purificadas das peconhas de Bothrops insularis e Bothrops brazili
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2004) Modesto, Jeanne Claine de Albuquerque [UNIFESP]
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    Efeitos de metaloproteases do veneno de jararaca (Bothrops leucurus) e do veneno de aranha marrom (Loxosceles intermedia) sobre células endoteliais e componentes da matriz extracelular
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006) Gremski, Luiza Helena [UNIFESP]; Veiga, Silvio Sanches [UNIFESP]
    A nova metaloprotease fibrinolítica isolada do veneno de Bothrops leucurus, denominada leucurolisina-a (23kDa), apresenta-se como um componente de significativo potencial terapêutica para o tratamento de distúrbios de coagulação, pela sua capacidade de dissolução de trombos. A caracterização dessa enzima mostrou similaridade de seqüência com outras metaloproteases de veneno de cabra que pertencem à classe P-I, além de exibir o sítio catalítico consenso para ligação do íon zinco. É destituída de atividade hemorrágica. Além de fibrinolítica, a enzima mostrou atividade também sobre fibronectina e fibrinogênio. No entanto, a laminina, não foi degradada pela protease, assim como o colágeno I. A protease inibiu a agregação plaquetária induzida por ADP de maneira dose dependente. O efeito citotóxico da leuc¬a sobre células endoteliais em cultura pôde ser observado apenas quando a exposição ocorreu em tempos prolongados e com altas concentrações da metaloprotease. Quando nessas condições, as células expostas alteram a sua morfologia por uma diminuição da adesão, tornando-se arredondadas e culminando no desprendimento lotal do substrato. Não houve redução da viabilidade das células endoteliais expostas à leuc-a em concentrações moderadas. Quando a sua concentração e tempo de exposição foram aumentados de maneira significativa, as células desprendidas perderam sua estabilidade estrutural, o que resultou na lise de parte delas. A atividade do veneno total de B. leucurus sobre as células endoteliais foi similar à leuc-a, porém numa intensidade muito maior. Outra metaloprotease purificada do veneno de Bothrops leucurus pelo grupo foi uma enzima pertencente à classe P-III das metaloproteases de venenos de serpentes (55 kDa). Resultados preliminares mostram uma atividade hemorrágica intensa por parte dessa protease. Análises do perfil proteolítico dessa nova metaloprotease caracterizaram-na com uma potente α-fibrinogenase. A metaloprotease de 55 kDa não mostrou atividade proteolítica sobre laminina e degradou apenas parcialmente colágeno IV. No entanto, mostrou atividade bastante potente sobre a entactina. Análises da atividade dessa protease sobre os colágenos do tipo I e IV mostraram apenas degradação parcial. No entanto, quando testada sobre gelatina essa protease de massa molecular aproximada de 55 kDa comporta-se com uma gelatinase. Diversas metaloproteases também já foram isoladas e caracterizadas nos venenos de aranhas marrons (gênero Loxosceles). Quando células endoteliais em cultura foram expostas ao veneno do L. intermedia observou-se uma profunda alteração na morfologia dessas células, tornando-se arredondadas e com longas filopodia sendo projetadas da periferia da célula. A marcação dos filamentos de actina e da vinculina por fluorescência, mostrou a desorganização do citoesqueleto e reorganização dos pontos de adesão focal, eventos estes que acontecem simultaneamente com as mudanças morfológicas observadas. Houve diminuição do perfil de adesão das células sobre fibronectina após exposição ao veneno de L. intermedia. Além disso, a imunomarcação da fibronectina na matriz extracelular das células em cultura expostas ao veneno confirmou a atividade fibronectinolítica do veneno. Esse resultado, junto com a observação da ligação direta do veneno à superfície celular, pode explicar a citotoxicidade induzida pelo veneno sobre as células endoteliais.
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    Estudo da correlacao da expressao genica e proteica das metaloproteinases com os parametros clinicos e achados anatomopatologicos no cancer colo-retal
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2012) Silva, Sandra Regina Morini [UNIFESP]
    Objetivo: Analise da expressao genica e proteica das metaloproteinases 1, 2, 9, 11 e 16 e sua correlacao com dados clinicos e anatomo-patologicos do adenocarcinoma colo-retal. Metodos: Estudo retrospectivo de 114 pacientes com adenocarcinoma colo-retal tratados cirurgicamente, no periodo de 2006 a 2008 no Hospital de Cancer de Barretos. A avaliacao da expressao genica foi feita por RTPCR; e proteica por estudo imuno-histoquimico. A analise da expressao genica foi classificada em genes super-expressos e pouco expressos (fold change de de aproximadamente 2, p< 0,05) . A positividade dos marcadores no estudo imuno-histoquimico foi realizada atraves da analise semi-quantitativa. A leitura das laminas de TMA (Tissue Microarray) foi feita por 2 patologistas de forma independente. Resultados: As expressoes genicas validadas pelo estudo imuno-histoquimico foram as MMP-1 (p= 0,001 e fold change de 1,57) e MMP-2 (p= 0,01 e fold change de u1,84) quando correlacionadas com os tipos histologicos mucinoso e adenocarcinoma SOE , as MMP-9 (p= 0,01 e fold change de 1,13) e MMP-16 (p= 0,03 e fold change de 1,61) quando comparadas com os tipos histologicos viloso e adenocarcinoma SOE; a MMP-11 apresentou significancia estatistica em relacao ao genero masculino (p=0,04 e fold change de 1,65). Conclusao: As MMPs 1, 2, 9, 11 e 16 apresentaram expressao genica e proteica com significancia estatistica em pelo menos uma das variaveis clinico-patologica estudadas. Sendo assim, concluimos que essas MMPs apresentam potencial como fator prognostico do adenocarcinoma colo-retal
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    Identificação da expressão de proteases intracelulares e extracelulares no desenvolvimento renal de ratos: correlação com o fator de crescimento hepatócito (HGF)
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2004) Cabrera, Adriana [UNIFESP]; Santos, Oscar Fernando Pavão dos [UNIFESP]
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    Isolamento e atividades de tres proteinase basicas do veneno de Bothrops moojeni
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1991) Serrano, Solange Maria de Toledo [UNIFESP]
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    Modulação de respostas de células endoteliais (HUVECs) induzidas por proteases fibrino(geno)liticas e ativadores de coagulação, obtidas de venenos animais
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2005) Fritzen, Marcio [UNIFESP]; Chudzinski-Tavassi, Ana Marisa [UNIFESP]
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    Papel do diferentes dominios de metaloproteases de venenos botropicos nas alteracoes da interacao leucocito-endotelio da microcirculacao do musculo cremaster de camundongos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2012) Zychar, Bianca Cestari [UNIFESP]
    Nos envenenamentos botropicos sao observadas intensas reacoes locais, resultado da hemorragia e resposta inflamatoria no local da picada. Dos componentes presentes nestes venenos as metaloproteases sao consideradas uma das principais responsaveis por estas atividades. As SVMP (Snake venom metalloproteinase) sao divididas por subclasses de acordo com a organizacao dos seus dominios (PI a PIII). Sabe-se que determinadas acoes biologicas destas toxinas sao atribuidas a dominios especificos. Usando tres SVMPs, avaliamos a participacao dos diferentes dominios nas alteracoes das interacoes leucocitoendotelio (ILE) apos a exposicao a essas toxinas na microcirculacao do cremaster de camundongos, sendo tambem avaliada a acao de inibidores de proteases nessas alteracoes. Para tanto utilizamos a jararagina (Jar), uma SMVP classificada como PIII, com uma forte atividade hemorragica, constituida pelo dominio catalitico, ECD-desintegrina e rico-cisteina; Jar-C, uma forma degradada de Jar desprovida do dominio catalitico, sem atividade hemorragica e BnP1, uma SMVP hemorragica classificada como PI, que possui apenas o dominio catalitico. Toxinas (0.5μg) ou PBS (100 μL) foram injetadas na bolsa escrotal de camundongos. Leucocitos aderidos e migrados foram contados em venulas pos-capilares por microscopia intravital 2 ou 24 h apos as injecoes. Observou-se aumento de leucocitos aderidos e migrados, apos 2 e 24 h da injecao das toxinas, respectivamente. A ILE ocorre pela expressao de moleculas de adesao da superficie de leucocitos e no endotelio vascular, assim verificamos a expressao proteica e genica das moleculas expressas no endotelio vascular: ICAM-1 e PECAM-1 envolvidas na adesao e migracao celular, respectivamente. E das integrinas LFA-1α(CD11a) e Mac-1α(CD11b) expressas em leucocitos. Houve aumento de ICAM-1, CD11a e CD11b nos tempos iniciais, e aumento na expressao de PECAM-1 em tempos mais tardios, nos grupos injetados com as toxinas. Inibindo-se a atividade catalitica da Jar e da BnP1 pelo tratamento com 1,10-fenantrolina (oPhe) houve uma completa inibicao das alteracoes, quando comparada aos efeitos induzidos pelas toxinas sem inibicao. Uma vez que a Jar, tambem possui os dominios ECD-disintegrina e rico-cisteina, e os resultados com Jar-C mostram que esses dominios tambem sao capazes de induzir alteracoes na ILE, estudamos se o tratamento com oPhe promoveu alguma alteracao conformacional na Jar por dicroismo circular. A estrutura da Jar foi alterada, indicando que este quelante promove a perda de uma parte da estrutura da Jar, e que esta associada, a diminuicao da quantidade de estruturas em alfa-helice. Ainda para identificarmos se as alteracoes ocorridas na Jar pelo tratamento com oPhe estavam restritas ao dominio metaloprotease ou atingiam tambem o dominio ECDdisintegrina, foi feita um ensaio de adesao ao colageno tipo I, demonstrando que nao houve diferencas entre Jar, Jar-C ou Jar-oPhe para se ligar ao colageno, sugerindo que o(s) sitio(s) da Jar que causa(m) alteracoes das ILE nao seja o mesmo que atue na interacao da toxina ao colageno. A resistencia de serpentes e alguns mamiferos aos efeitos toxicos do veneno de serpentes sao conhecidos. Um desses inibidores, o BjKgn (Bothrops jararaca kininogen) isolado do plasma de Bothrops jararaca, tambem foi testado e verificamos sua efiCiência em inibir as alteracoes da ILE causadas pela Jar ou BnP1. Esse efeito foi similar ao observado quando estas toxinas foram tratadas com oPhe, apesar do BjKgn nao atuar como um quelante, seu efeito inibitorio mostrou-se associado ao dominio metaloprotease das SVMP, ja que a mistura de Jar-C e BjKgn, apresentou inibicao parcial desses eventos celulares. Em conjunto nossos dados sugerem que o dominio catalitico das SVMP sao as principais reposnsaveis pelas alteracoes das ILE, e aparentemente os dominios ECD-disintegrina e rico-cisteina destas toxinas precisam estar separados do dominio catalitico para induzir estas alteracoes. Apesar das diferencas nas atividades hemorragica e na composicao dos dominios, as tres toxinas utilizadas induziram alteracoes similares na ILE, pela expressao das moleculas ICAM-1, CD11a, CD11b e PECAM-1