Navegando por Palavras-chave "Glicosaminoglicanos"

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    Ação de um Peptídeo Derivado do Lopap em Cultura de Fibroblastos e em Modelo Experimental de Lesão Cutânea em Ratos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2009-06-24) Wlian, Luana [UNIFESP]; Tavassi, Ana Marisa Chudzinski [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The process of tissue repair is a complex of reactions between cells and biochemical mediators that are triggered from an injury. This study evaluated the effect of peptide 4 derived from the amino acid sequence of Lopap (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) in culture of fibroblasts to evaluate the expression of molecules of extracellular matrix and the membrane receptors of interleukin-8 and in experimental model of skin lesion in rats to examine the effect of the molecule in the process of tissue repair. We used 40 male Wistar rats with 6 to 8 weeks, randomized to 5 experimental groups. After anesthesia, the rats were submitted to surgery, where eight circular full-thickness of skin from 6 mm of diameter were surrounded in the back and treated with saline or with peptide 4. After different periods (days 3, 7, 14 and 21 days after wounding) were carried out tests to evaluate the process of tissue repair between the groups. We conclude that peptide 4 is able to stimulate fibroblasts in culture and promote the acceleration of the process of tissue repair in vivo model with greater deposition of collagen, glycosaminoglycans and better tissue reorganization.
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    Alteração no conteúdo de glicosaminoglicanos modula alostericamente os canais para prótons sensíveis à voltagem
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022) Orts, Diego Jose Belato Y [UNIFESP]; Miranda Filho, Manoel de Arcisio [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/2680038286691388; http://lattes.cnpq.br/2478214017855756
    Canais para H+ sensíveis à voltagem (HV1) foram encontrados em muitas células de mamíferos e desempenham um papel crucial em diversos sistemas, como no sistema imunológico, na fertilidade masculina e na progressão do câncer. Os glicosaminoglicanos desempenham um papel significativo em vários aspectos da fisiologia celular, incluindo a modulação dos receptores de membrana e a função de canais iônicos. Nesta tese de doutorado, apresentamos evidências de que a mecanosensibilidade do canal HV1 dimérico transduz alterações na fluidez da membrana celular relacionadas à deficiência na biossíntese de sulfato de condroitina e sulfato de heparana em células de ovário de hamster chinês (CHO-745) em um deslocamento para a esquerda na dependência da voltagem de ativação. Este efeito é acompanhado por um aumento na corrente de H+ e uma aceleração da cinética de ativação, sob condições de gradiente de pH (ΔpH) simétrico ou assimétrico. Alterações semelhantes no mecanismo de ativação (gating) foram observadas em duas isoformas do canal HV1 em que a região N-terminal apresenta deleções de aminoácidos. Em três mutantes criados para impedir a dimerização do canal HV1, não foram observadas as alterações nos parâmetros biofísicos. Além disso, mostramos que o gating do canal HV1 pode ser modulado pela manipulação da fluidez da membrana das células CHO-K1. Nossos resultados sugerem que a biossíntese defeituosa de sulfato de condroitina e sulfato de heparana nas células CHO-745 aumenta a fluidez da membrana e modula alostericamente o acoplamento entre detecção de voltagem e ΔpH através do gating cooperativo do canal HV1 dimérico.
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    Embargo
    Análise de glicosaminoglicanos e proteoglicanos em linhagens tumorais de próstata
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-10-27) Aquino, Renata de Oliveira [UNIFESP]; Toma, Leny [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Proteoglicanos (PG) são macromoléculas encontradas na superfície celular, matriz extracelular e grânulos citoplasmáticos, que desempenham importante papel na interação célula-célula e célulamatriz. Diversos estudos mostraram alterações significantes no conteúdo de PG encontrados no estroma do tumor, e estas mudanças influenciam o crescimento e invasão tumoral. No presente estudo, células de câncer de próstata DU145 e PC3, de diferentes origens metastáticas, cérebro e osso, respectivamente, foram analizadas num estudo comparativo para GAGs e PGs. Marcação das células com [35S] Na2SO4 e análise estrutural dos GAGs com enzimas específicas, mostraram aumento de produtos 6-O-sulfatados no HS e CS das células PC3, comparado à DU145. Produtos de HS das células PC3 foram representadas pelo aumento de dissacarídeos Nacetilados- 6-O-sulfatados (DGlcA-GlcNAc,6OS) e dissacarídeos trissulfatados (DIdoA,2S-GlcNS,6S). Produtos 6- e 4-O-sulfatados (DUGalNAc4S, 6S) também estão presentes no CS das células PC3, mas em menor quantidade na DU 145. Estudos na literatura têm demonstrado a presença de Ido.A,2S como requerimento fundamental para a ligação de HS ao bFGF. Contudo, estudos ainda mostraram a necessidade de requerimentos estruturais adicionais de 6-O-sulfatação de resíduos de glucosamina-N-sulfato para a promoção da atividade mitogênica do fator de crescimento. Altos níveis de PGHS foram encontrados em ambas as células, comparado a PGCS. Sindecam-1 está diminuído em células PC3, em relação à DU145. Entretanto, uma compensação ocorreu com um aumento de sindecam-2, detectado por PCR em tempo real, e corroborado por microscopia confocal e citômetro de fluxo com dupla marcação. A presença de sindecam-2 nas células PC3, além de alterações na distribuição subcelular, comparada à DU145, representa possivelmente um papel importante na carcinogênese prostática. Com relação aos estudos de migração, as células DU145 mostraram perfil mais migratório, talvez devido às vantagens seletivas para extravazamento adquiridas por este tipo de células para superar a barreira da membrana hematoencefálica. Coletivamente, estes reultados demonstram características bioquímicas e celulares diferentes encontradas nas duas linhagens celulares, que refletem as peculiaridades da colonização órgão-específica e seleção celular que ocorrem durante o processo de metástase.
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    Restrito
    Análise morfofuncional da matriz extracelular aortica de ratos wistar submetidos à dieta hipersódica
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-09-01) Souza, Vanessa Rodrigues de [UNIFESP]; Borges, Luciano de Figueiredo [UNIFESP]; Lacchini, Silvia; http://lattes.cnpq.br/1388456714004346; http://lattes.cnpq.br/6933592497390944; http://lattes.cnpq.br/1100356817456544
    Objetivo: As doenças cardiovasculares constituem uma das principais causas de morte no Brasil e no mundo. O alto consumo de cloreto de sódio (sal) na dieta é um problema relacionado ao desencadeamento dessas doenças. Experimentos com animais vêm sendo realizados a fim de desvendar os mecanismos associados ao “sal” como fator de estresse. Fora verificado em estudos anteriores que a sobrecarga salina com NaCl 1% provocou remodelamento vascular com produção local de substâncias pró-inflamatórias (Angiotensina II), independentemente da elevação da pressão arterial. Ratos Wistar machos com 4 semanas de idade foram empregados e acompanhados até a 16ª semana de vida com objetivo de estudar a organização da matriz extracelular (MEC). Métodos: Os animais foram randomicamente separados em dois grupos experimentais: controle ou sobrecarga salina com NaCl 1% na água de beber durante doze semanas. Ao final do tratamento os animais foram submetidos à gaiola metabólica e também à avaliação da pressão arterial. A artéria aorta foi coletada e preparada para análise histológica dos seguintes componentes da MEC: fibras de colágeno (coloração pelo Sírius Red), proteoglicanos (PGs) e glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados e carboxilados (colorações pelo Azul de Alcian pH 2,5 e Azul de Toluidina pH 7,0). Resultados: Este modelo de sobrecarga salina não induziu importantes alterações hemodinâmicas sistêmicas do ponto de vista clínico, mas foi capaz de provocar alterações na organização dos elementos matriciais. Possivelmente a dieta hipersódica desencadeou mecanismos regulatórios, que apesar de não alterar drasticamente a quantidade dos elementos da MEC, provocou alterações na organização dos mesmos. Conclusão: É possível que o desarranjo da MEC seja resultado da ação de proteases matriciais desencadeado por uma alteração hemodinâmica regulatória local. Portanto, a redução no consumo de sal é recomendada tendo em vista a manutenção da histofisiologia cardiovascular, inclusive para indivíduos normotensos. Mais estudos serão necessários para uma investigação mais criteriosa. Porém, estes indícios encontrados contribuem para a geração de evidências que visam elucidar os mecanismos associados aos malefícios do excesso de sal na dieta, colaborando para o delineamento de estratégias preventivas e terapêuticas
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    Avaliação do colágeno no osso de ratas diabéticas tipo 1 tratadas com isoflavonas
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-11-29) Vieira, Magno César [UNIFESP]; Simões, Manuel de Jesus [UNIFESP]; Carbone, Adriana Aparecida Ferraz [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9174521191304809; http://lattes.cnpq.br/5987164343458678; http://lattes.cnpq.br/5998705224419140
    Neste trabalho, o modelo “ratas diabéticas ovariectomizadas” foi utilizado pensando nas mulheres em menopausa e diabéticas com um tratamento alternativo com isoflavonas da soja, baseamo-nos em dados que mostram um aumento no número de mulheres que procuram utilizar-se de terapias hormonais. Objetivo: Analisar a matriz extracelular no osso de ratas diabéticas tratadas com isoflavonas ou 17β- estradiol. Métodos: Foram utilizadas 60 ratas (Rattus norvegicus albinus), fêmeas, adultas, ±3 meses de idade. Os animais foram separados em seis (6) grupos, a saber: controle Sham (n=10) animais não ovariectomizados na fase de estro; Sham+DM (n=10) controle Sham ratas diabéticas não ovariectomizadas na fase de estro; OVX (n=10) controle, ratas ovariectomizadas que receberam veículo propilenoglicol; OVX+DM (n=10) ratas diabéticas ovariectomizadas que receberam veículo propilenoglicol (fase de estro); OVX+DM+ISO (n=10) animais diabéticos ovariectomizados tratados com isoflavonas da soja (150mg/Kg, por gavagem); OVX+DM+E2 (n=10) animais diabéticos ovariectomizados tratados com estrogênio (17β-estradiol, 10μg/Kg, por via subcutânea). Para a indução do diabetes Tipo 1, as ratas receberam uma única injeção intraperitoneal de 60 mg/Kg de estreptozotocina (STZ, Sigma-Aldrich). O diabetes foi confirmado três dias após a injeção da estreptozotocina. Todos os animais foram tratados durante 30 dias consecutivos, e ao final, os animais foram anestesiados e os fêmures removidos e processados para estudo em H.E. e Picro Sirius Red. Para a análise dos resultados foi utilizado Oneway ANOVA seguido do teste de Tukey. Foram considerados estatisticamente significativos experimentos cujo valor de p foi menor que 5% (p ≤ 0,05) para significância estatística. Os cálculos foram feitos com o programa SPSS versão13 (SPSS, Chicago, IL). Resultados: Os resultados obtidos foram os seguintes: Peso corporal: não foi diferente entre os grupos não diabéticos Sham e OVX e, os grupos de ratas diabéticas Sham+DM, OVX+DM, OVX+DM+ISO e OVX+DM+E2 (p>0,05). No entanto, houve uma diminuição significativa do peso corporal nos grupos de ratas diabéticas em comparação com os grupos não diabéticas Sham e OVX (p<0,001). Sensibilidade à Insulina: Os valores mais baixos de insulina tolerância foram observadas no OVX+DM (2,41±0,95). Os grupos Sham (4,64±0,95) e OVX (4,57±0,58) apresentaram os maiores valores de sensibilidade à insulina (p<0,001). x Os grupos OVX+DM+ISO e OVX+DM+E2 apresentaram valores semelhantes, inferiores aos Sham e OVX e superior ao grupo OVX+DM. Histomorfometria e Análise Bioquímica de Glicosaminoglicanos Sulfatados: O volume do osso trabecular foi maior nos grupos de ratas diabéticas ovariectomizadas OVX+DM+E2 (26,35±2,13) e OVX+DM+ISO (18,36±173), tratadas, respectivamente, com 17β estradiol e isoflavonas e menor no OVX+DM (8,32±2,52), grupo de ratas diabéticas ovariectomizadas que receberam veículo propilenoglicol em fase de estro. Resultados semelhantes foram encontrados em relação à espessura do osso cortical, que foi maior no OVX+DM+E2 (398,4±1,74) e OVX+DM+ISO (295,6±1,45) e menor no OVX+DM (142,6±2,74) (p<0,05). Com relação ao sulfato de condroitina foi encontrado nos ossos de todos os grupos de animais estudados. Picro Sirius Red: As fibras colágenas de substância óssea trabecular e cortical das epífises dos fêmures apresentaram maior intensidade de birrefringência nos grupos (OVX+DM+ISO 330,2±2 e OVX+DM+E2 414,8± 33,7) tratados, respectivamente, com isoflavonas e 17β estradiol
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    Avaliação prostpectiva de heparam sulfato, condroitim sulfato e ácido hialurônico em pacientes com câncer de próstata
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2018-06-28) Silva, Matheus Neves Ribeiro Da [UNIFESP]; Pinhal, Maria Aparecida Da Silva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7511274763693292; http://lattes.cnpq.br/8143551334488274; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Prostate cancer in Brazil represents the most common type of cancer among men after skin cancer. Although there are effective tests for the diagnosis of prostate cancer, there are still discussions about the most appropriate and non-invasive method for such diagnosis, always looking for less invasive methods to evaluate the possible prognosis of the disease. The present study aimed to evaluate urinary levels of chondroitin sulfate (CS) and heparan sulfate (HS), as well as plasma levels of hyaluronic acid (HA) in patients with prostate cancer, before and after treatment, compared with individuals which was not affected by neoplasia. Plasma samples were used to quantify AH and urine for CS and HS quantification from forty-four patients with prostate cancer and fourteen controls (non-affected individuals). Laboratory and pathological clinical data were correlated with the quantification of glycosaminoglycans by statistical analysis. There was no difference in the urinary levels of CS and HS among patients with prostate cancer and the control group. However, sulfated glycosaminoglycans (HS and CS) were analyzed in urine samples collected before and after treatment, and an increased in urinary excretion of heparan sulfate was observed after surgery, followed by decrease in the excretion of chondroitin sulfate after hormone therapy. The level of serum hyaluronic acid showed a significant increase in patients with prostate cancer (39.68 ± 30.00 ng / ml), compared to the control group (15.04 ± 7.11 ng / ml), p = 0.004. We also observed a significant increase in hyaluronic acid in patients with high-risk of prostate cancer, following the D'Amico classification, compared to low-risk patients (p = 0.0214). Patients submitted to surgery had a significant reduction in the level of AH (p = 0.029). The quantification of serum hyaluronic acid represents a noninvasive test with potential use in the diagnostic and prognostic evaluation of prostate cancer. Future studies are essential to confirm the unprecedented but preliminary results obtained in the present study.
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    Biossíntese de glicosaminoglicanos sulfatados: novos enfoques para o estudo de atividades e interações das enzimas do Golgi
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2011-07-27) Ferreira, Tarsis Gesteira [UNIFESP]; Nader, Helena Bonciani [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Heparam sulfato (HS) é um glicosaminoglicano altamente modificados (GAGs) ligados a um core proteíco, formando os proteoglicanos de heparam sulfato (HSPGs). A estrutura do HS é caracterizada por padrões de modificações específicas, dependendo do tipo celular, da idade e do organismo. A estrutura das cadeias de açúcar do HS são importantes na modulação da atividade dos HSPGs. A biossíntese do HS é conservada a partir de nematóides até o homem, iniciando no sistema retículo endoplasmático / cis-Golgi, onde uma ligação de tetrassacarídeo é adicionado a um resíduo de serina do core proteíco do proteoglicano. Após a adição covalente de um resíduo de xilose pela xilosil transferase, três diferentes enzimas adicionam os resíduos de galactose-galactose-ácido glucurônico, constituindo assim a região de ligação, sendo este último passo essencial para o complexo de polimerases EXT1 e EXT2 acrescentarem unidades alternadas de ácido glucurônico (GlcA) e glucosamina N-acetilada (GlcNAc) na região não-reduzida da cadeia. Após esta etapa de polimerização, um conjunto de modificações ocorrem: Ndesacetilação / N-sulfatação da GlcNAc pela enzima bifuncional, glucosaminil N-desacetilase / N-sulfotransferase, epimerização do ácido glucurônico adjacente ao recente domínio N-sulfatado pela glucuronosil C5 epimerase, e por fim, 2, 3 e 6-O sulfatação por diferentes sulfotransferases com distribuição tecido e isoformas específicas. A regulação dessas reações, bem como o mecanismo de sulfatação, são mal compreendidos. Além da evidência fragmentada, existe uma interrogação sobre a sistemática das interações bioquímicas da maquinaria biossintética do HS. N-Desacetilase-Nsulfotransferase 1 (Ndst1) promove a catálise inicial das modificações do HS e Heparina (Hep), removendo os grupos acetil das unidades de Nacetiglucosamina com subseqüente sulfatação dos amino grupos livres. Utilizando uma biblioteca de Phage Display, selecionamos com sucesso dois peptídeos que interagem especificamente com a Ndst1, inibindo sua atividade de sulfatação. Inibidores da maquinaria biossintética dos GAGs são importantes ferramentas para o estudo deste evento, bem como, na alteração da composição das cadeias de açúcar do HS em modelos in vitro. Ainda, utilizando as ferramentas de molecular docking e dinâmica molecular, fomos capazes de estudar com detalhe o sítio catalítico da NDST de origem humana e decifrar a relevância da precisão catalítica dos resíduos limitantes através da fenda hidrofóbica, bem como, a sua significância para o reconhecimento e sulfatação do glicano. Além disso, nós determinamos o resíduo de aminoácido essencial para a ligação ao hNDST, Finalmente, utilizando ambas tecnologias de identificação multidimensional da proteína e imunohistoquímica, fomos capazes de demonstrar inicialmente a presença e a localização tecidual dos diferentes proteoglicanos em diferentes órgãos do gastrópode Achatina fulica. A. Fulica é um modelo vital para a caracterização da especificidade e o modo de ação das enzimas envolvidas na biossíntese dos GAGs, pois a estrutura do GAG acaram sulfato, encontrado somente neste organismo, contradiz a atual teoria biossintética. Além disso, pela análise proteômica das proteínas isoladas do Golgi da A. fulica, bem como, a imunohistoquímica das secções dos tecidos, detectamos a presença da maquinaria de biossíntese dos glicosaminoglicanos. Portanto, este estudo busca elucidar a atividade da NDST, além de, fornecer novas técnicas e abordagens originais para o estudo da biossíntese dos GAGs.
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    Correlação entre os glicosaminoglicanos, proteoglicanos e colágenos e a gravidade da doença de Dupuytren
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-11-27) Lenzi, Luiz Guilherme De Saboya [UNIFESP]; Faloppa, Flavio [UNIFESP]; Nader, Helena Bonciani [UNIFESP]; Santos, João Baptista Gomes dos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7175631659428994; http://lattes.cnpq.br/2431910521925594; http://lattes.cnpq.br/3695111273396745; http://lattes.cnpq.br/8191223392689753
    Introdução: A doença de Dupuytren (DD) é uma condição fibroproliferativa típica da mão, resultante de fatores genéticos, epigenéticos e ambientais. Sua origem está relacionada à síntese de matriz extracelular (MEC), uma rede complexa de diferentes tipos de macromoléculas. Alterações em seu conteúdo e disposição têm impacto nos processos fisiológicos normais e nas condições patológicas. Objetivo: correlacionar os glicosaminoglicanos, proteoglicanos e colágeno na matriz extracelular de doentes com diferentes estágios clínicos da doença de Dupuytren. Métodos: O estudo envolveu 14 pacientes categorizados em quatro grupos com base nos seus estágios I, II, III e IV. A análise das moléculas foi realizada a partir da biópsia da fáscia palmar e de amostras de urina, por meio da utilização de métodos cromatográficos, análises de mRNA, detecção de proteínas na microscopia confocal e microscopia CARS (microscopia de dispersão coerente antistokes de Raman). Resultados: Foram observadas alterações significantes no conteúdo e disposição do condroitim sulfato, dermatam sulfato e colágeno na fáscia palmar dos doentes em comparação com o tecido normal, independentemente do grau da doença. Pela primeira vez na literatura, foi possível associar o aumento da expressão do versicam, agrecam e do decorim de forma significante. Além disso, a excreção de glicosaminoglicanos sulfatados está significantemente diminuída na urina dos doentes com DD. Conclusão: Os dados indicam que os proteoglicanos e a disposição do colágeno são possíveis marcadores do estádio da doença. Ademais, a diminuição da excreção urinária de glicosaminoglicanos sugere um efeito sistêmico da doença.
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    Distribuição comparativa dos glicosaminoglicanos em artérias e veias de diferentes mamíferos
    (Sociedade Brasileira de Cirurgia Cardiovascular, 1999-10-01) Marquezini, Mônica V.; Dallan, Luís Alberto O.; Toledo, Olga M. S. [UNIFESP]; Pró-Sangue Fundação Hemocentro de São Paulo; Universidade de São Paulo (USP); Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A comparative analysis of the glycosaminoglycan distribution in arteries and veins of humans, rats and dogs was realized. The results showed that the glycosaminoglycan distribution of the arteries was similar to that of venous tissues, where dermatan sulfate was the main glycosaminoglycan found. However, the proportion of dermatan sulfate is significantly greater in venous than in arterial tissues, in the three species. The total amount of the glycosaminoglycans was significantly higher in arteries than in veins, and the highest contents were found in the aortas. These increases may be associated with structural differences of the wall of these two types of blood vessels walls. The blood pressure is significantly lower in venous tissues and veins may exhibit less compressibility than arterial. These findings open perspectives for a better understanding of biochemical changes that could be related to the progressive degenerative vascular process, especially in the structural changes that saphenous veins undergo, when used as grafts in myocardial revascularization.
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    Somente Metadadados
    Efeito dos glicosaminoglicanos na adesão e internalização celular de nanopartículas de poliestireno
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2021) Olivieri Junior, Paulo Henrique [UNIFESP]; Sousa, Alioscka Augusto Caldeira Araujo [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo
    Understanding the factors that regulate cellular endocytosis of synthetic nanoparticles is an important objective in many fields of science and technology, for example, in nanomedicine in applications covering drug delivery. However, despite decades of study in the field, predicting (or even explaining) specific results remains a challenge. This is not surprising, considering the many factors that can influence nanoparticle– cell interactions. One of these factors concerns the negatively charged glycosaminoglycans (GAGs) that integrate the cellular glycocalyx. Despite its importance, so far only a few studies have examined the impact of GAGs on cellular internalization of nanoparticles. Therefore, the main objective of this work was to understand the influence of surface GAGs in the internalization process of nanoparticles. Anionic and cationic polystyrene nanoparticles of 50 nm in diameter were used as a model system. Wild-type CHO (CHOK1) and mutant (CHO-745, deficient in GAG synthesis) cells were used as a model cell line. The influence of the specific GAGs heparan and chondroitin sulfates (HS and CS) on particle internalization was also evaluated through the selective enzymatic removal of these GAGs in the wild-type cells. All experimental steps were meticulously standardized to minimize variability between experiments. The results showed that the surface GAGs acted as an electrostatic filter, hindering the uptake of negatively charged particles, while enhancing the uptake of those with positive charge. Data obtained from the selective removal of HS and CS indicated that the 'electrostatic filter' function was performed mainly by HS, which is in accordance with its greater negative charge density relative to CS.
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    Efeito modulatório de proteoglicanos sobre a atividade da enzima óxido nítrico sintase endotelial em células CHO
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-04-29) Lucena, Sheyla Varela [UNIFESP]; Tersariol, Ivarne Luis dos Santos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4859954582615304; http://lattes.cnpq.br/2148891529881163; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introdução. A interação das células com a matriz extracelular (MEC) e com as células vizinhas são essenciais para o desempenho das funções celulares. A maneira pela qual as células adquirem informações sobre o meio extracelular se dá por meio de interações mediadas por receptores específicos entre a MEC e os constituintes de superfície celular, tais como, integrinas, proteoglicanos entre outros. Dados da literatura mostram que os proteoglicanos, via suas cadeias de glicosaminoglicanos (GAGs), são capazes de interagir com várias proteínas da MEC e com integrinas da superfície celular que por sua vez, interagem com moléculas da MEC. Essas interações GAGs/integrina modulam a formação do complexo ternário integrina/GAGs/proteínas da MEC controlando dessa forma o papel biológico das integrinas. Estímulos mecânicos derivados da MEC podem ser transmitidos para o meio intracelular pela interação direta ou indireta das integrinas que se associam com proteoglicanos em regiões de "lipíd rafts" e no complexo focal de adesão controlando a produção intracelular de NO. [Objetivos] Considerando que os proteoglicanos controlam a atividade de integrinas na superfície celular, decidimos investigar a influência dos GAGs nos mecanismos responsáveis pela produção de óxido nítrico em células selvagem CHO-K1, bem como, em células mutante CHO-745, defectiva da enzima xilosiltransferase, enzima fundamental para a biossíntese de GAGs. [Métodos] Analisamos o balanço redox nas células CHO-K1 e CHO-745 pela quantificação de GSH/GSSG, de grupos tióis, da razão NADP/NADPH, bem como, pela análise da expressão gênica das enzimas GPx, TRX e catalasepor RTPCR. Analisamos a susceptibilidade das células CHO para a morte celular frente a sobrecarga do agente pró-oxidante. Os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROS), de superóxido e de óxido nítrico foram analisados em ambas as linhagens celulares CHO por sondas fluorescentes em microscopia TIRF e confocal. Também foi analisada a expressão gênica das isoformas de NADPH oxidase e NO sintase envolvidas na produção de superóxido e NO nas células CHO por westem blottíng e citometria de fluxo. A localização celular da enzima eNOS nas células CHO foi analisada por microscopia confocal. Verificamos a via de sinalização celular envolvida no controle da atividade da enzima eNOS nas células CHO por western blotting, microscopia TIRF e confocal. [Resultados]. Nossos resultados mostram que as células mutantes CHO-745 são mais susceptíveis a morte celular induzida por agente pró-oxidante que as células selvagem CHO-K1. Verificamos que as células mutantes CHO-745 produzem espontaneamente cerca de 12 vezes mais EROS do que as células selvagens CHO-K1. A principal fonte de EROS produzidos espontaneamente pelas células CHO-745 está associada a sua elevada produção de NO, o qual também cerca de 12 vezes maior nas células mutantes CHO-745 em relação às células selvagem CHO-K1. Os resultados mostram que a isoforma eNOS é a principal responsável pela produção de NO nas células CHO. Os resultados mostram que a presença de GAGs, verificada nas células CHO-K1 inibe a via de sinalização Integrina/FAKlPI3K/Akt,. a qual leva a ativação da eNOS por fosforilação de Ser1177. Além disso, as células CHO-K1 apresentam maior ativação constitutiva da enzima PKC, cerca de duas vezes mais, do que as células CHO-745. Essa ativação da PKCa resulta na fosforilação no resíduo inibitório Thr495 da eNOS. A elevada produção de NO nas células CHO-745 promoveu também uma elevada taxa de S-nitrosilação de resíduos de cisteína em suas proteínas, bem como, elevada taxa de nitração de grupos fenólicos de tirosina. Ainda foi observado que as células CHO-745 possuem uma concentração basal de superóxido menor em comparação com as células CHO-K1. Nossos resultados mostram que as células CHO-745 apresentam níveis elevados de expressão gênica das enzimas GPx, TRX e catalase em resposta a sua maior produção de EROs. [Conclusão] Esses resultados mostram que a enzima eNOS está muito mais ativada nas células mutante CHO-745 do que as células CHO-K1 devido a sua maior fosforilação do resíduo excitatório Ser1177 e menor fosforilação em seu resíduo inibitório Thr495, a fosforilização desses resíduos é modulada por GAGs/PG da superfície celular. Esses resultados mostram que os GAGs estão envolvidos no controle do balanço oxidativo/nitrosativo celular.
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    Estudo das alterações de proteoglicanos e glicosaminoglicanos em linhagens celulares de câncer colorretal humano
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2009-03-25) Ricci, Ritchelli [UNIFESP]; Toma, Leny [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Proteoglycans (PG) are complex macromolecules composed of linear polysaccharide chains, the glycosaminoglycans (GAGs), covalently attached to a core protein. These GAG chains contain sulphate groups at various positions, giving rise to specific domains, which allows them to interact with extracellular matrix molecules, including various growth factors. In this study, we have used a transwell coculture system to analyse the interaction between human fibroblasts stromal cells and human colonic carcinoma cell line (Caco-2) and investigate the effects of this interaction on cell proliferation and glycosaminoglycans synthesis. Soluble components exchanged between the cell lines in Transwell system caused a marked increase of Caco-2 cell proliferation, not observed on fibroblasts. An increase of GAGs biosynthesis was observed in both cell lines, whereas a prominent increase of CS was observed mainly in stromal cells, as determined by incorporation of 35SNa2SO4. Confocal microscopy showed significant increase of versican production by fibroblasts cells. TGF-â was also tested exhibiting a significant increase on GAG synthesis mainly in fibroblasts cells, producing a strong CS-stimulating response. These results suggest that this growth factor may be responsible for the CS increase observed in stromal cells. Caco-2 cells previously analyzed in this work were used to compare with a cell line with increased metastatic potential, HCT116. A normal rat intestinal epithelium cell line, IEC-6 was used as control. Labeling of cells with 35S-Na2SO4 and investigation of GAGs with specific enzymes showed an increased 6-O-sulfation of HS and CS. GAGs structural data were confirmed by Real Time PCR with elevation of specific heparan-6-O-sulfotransferase mRNA expression on Caco-2 and HCT116 cells, compared to IEC-6. The most extensively studied aspect of relationship between HS fine structure and growth factor signaling to date is the possible involvement of 6-Osulfation in the activation of FGF signaling. High levels of chondroitin-4,6-O-sulfotransferase expression was found only in HCT116 cells, whose CS structure contained GalNAc,4,6-sulfate, present on tetrasaccharides and disulfated disaccharides. The participation of the oversulfated structure on CS has been shown to promote tumoral cell motility. Whether these structural data obtained in this work correlate to the mentioned biological functions, remains to be elucidated.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Expressão de glicosaminoglicanos sulfatados e proteoglicanos de heparam sulfato em células endoteliais resistentes ao anoikis após tratamento com trastuzumabe
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017) Onyeisi, Jessica Oyie Sousa [UNIFESP] ; Azevedo, Carla Cristina Lopes de [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/0546695375822929; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Objetivo: Avaliar o efeito do trastuzumabe (Tmab) na expressão de glicosaminoglicanos sulfatados e proteoglicanos de heparam sulfato em células endoteliais resistentes ao anoikis. Métodos: Células endoteliais de aorta de coelho (EC), EC resistentes ao anoikis (Adh-EC) e EC transfectada com o oncogene EJ-ras (EJ-ras EC) foram tratadas com trastuzumabe e analisadas em relação a: capacidade adesiva, invasão, proliferação, angiogênese, ciclo celular, expressão e localização do sindecam-4, expressão de perlecam e síntese de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs). Resultados: Os resultados demonstraram que as células endoteliais anoikis-resistentes apresentam maior adesão à fibronectina e menor capacidade invasiva, proliferativa e angiogênica, após tratamento com trastuzumabe. Observamos também que, após o tratamento com o trastuzumabe, houve um aumento significativo no número de células na fase S do ciclo celular. Em relação à expressão do sindecam-4, perlecam e síntese de heparam sulfato (HS), observamos uma diminuição tanto na expressão do sindecam-4 e perlecam, bem como na biossíntese de HS nas células endoteliais resistentes ao anoikis após exposição ao Tmab. Por outro lado, as células endoteliais selvagens apresentaram aumento significativo na expressão de perlecam e na síntese de HS. Conclusão: Juntos, os resultados sugerem que o trastuzumabe não interage apenas com HER2, mas com glicosaminoglicanos e proteoglicanos tanto de superfície celular, como da matriz extracelular, e também, controla eventos celulares das células endoteliais resistentes ao anoikis.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Heterogeneidade molecular entre diferentes linhagens celulares estabelecidas de câncer de mama humano triplo-negativo
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-10-28) Ferreira, Ariana Carolina [UNIFESP]; Pinhal, Maria Aparecida da Silva [UNIFESP]; Melo, Carina Mucciolo [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1814847465463146; http://lattes.cnpq.br/7511274763693292; https://lattes.cnpq.br/7080145324327503
    Introdução: O câncer de mama triplo negativo (TNBC) representa de 15% a 20% dos casos de neoplasia maligna mamária, sendo constituído por tumores com características heterogêneas, com maior incidência de metástases, menor sobrevida dos pacientes e opções de tratamento limitadas, em que a terapia hormonal e os medicamentos direcionados ao receptor HER2 são ineficazes. Portanto, é crucial a identificação de biomarcadores moleculares que auxiliem no desenvolvimento de estratégias de tratamento mais efetivas e possíveis combinações utilizando terapias direcionadas. Objetivos: Caracterizar as linhagens celulares estabelecidas de câncer de mama triplo-negativo, MDA-MB-453, MDA-MB-231, HCC38 e BT-549, por análise do perfil de proliferação e migração celular, capacidade de formação de colônias, e determinar o padrão de expressão gênica de moléculas envolvidas com a carcinogênese (sindecans, heparanases, metaloproteases, glicosaminoglicanos, CD44 e HER2). Comparar a resposta das diferentes linhagens celulares triplo-negativas ao tratamento com Paclitaxel, bem como, avaliar possíveis alterações moleculares após tratamento. Métodos: A expressão gênica foi determinada por PCR quantitativo, microscopia confocal e citometria de fluxo. O perfil de glicosaminoglicanos foi obtido por eletroforese após incorporação de [35S]-sulfato. A resposta ao tratamento com Paclitaxel foi avaliada por ensaios de viabilidade celular (MTT) e morte celular (Anexina V/ PI). A resistência ao Paclitaxel foi obtida após tratamento contínuo das células MDA-MB-231 com tal quimioterápico. A compreensão do papel biológico do sindecam-4 (SDC4) foi feita por análises in silico e silenciamento utilizando short hairpin RNAs (shRNA). Resultados: A análise da expressão gênica revelou que as linhagens celulares triplo-negativas MDA-MB-453 e HCC38 expressam mRNA para HER2, sendo que tal receptor está ativado na linhagem HCC38. A expressão de CD44 foi significantemente menor nas células MDA-MB-453, sendo que tal linhagem não exibiu isoformas variantes do receptor (CD44v). As linhagens de origem metastática, MDA-MB-453 e MDA-MB-231, não exibiram as isoformas CD44v3I e CD44v5. As células triplo-negativas estudadas também exibiram diferentes perfis de glicosaminoglicanos sulfatados. As células HCC38 e BT-549, apresentaram maior expressão gênica de sindecam-4 e resposta mais efetiva ao Paclitaxel em relação às células de origem metastática, MDA-MB-453 e MDA-MB-231. Análises in silico evidenciaram que a baixa expressão de sindecam-4 (SDC4) está associada à presença de linfonodos metastáticos e baixa sobrevida dos pacientes acometidos por câncer de mama. O silenciamento gênico de SDC4 acarretou menor resposta ao tratamento com Paclitaxel. As células MDA-MB-231 resistentes ao Paclitaxel apresentaram alterações morfológicas e diminuição da expressão de SDC4. O tratamento quimioterápico foi capaz de induzir alterações significativas na expressão gênica das diferentes linhagens de câncer triplo-negativo. Conclusões: As linhagens celulares, embora pertencentes ao subtipo molecular triplo-negativo de câncer de mama, exibiram características moleculares e resposta ao tratamento quimioterápico distintos, evidenciando possíveis alvos para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais efetivas. Os dados in silico e in vitro mostraram a importância do SDC4 na tumorigênese do câncer de mama, sugerindo que tal molécula possa servir como potencial biomarcador para o prognóstico do câncer de mama e, desta forma, auxiliar na decisão de estratégias terapêuticas mais assertivas.
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    Somente Metadadados
    Interação do cininogênio humano de alta massa molecular com a superfície celular: envolvimento dos processos de endocitose e proteólise
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-06-30) Melo, Kátia Regina Brasil [UNIFESP]; Motta, Guacyara da [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Angiogenesis and hemostasis are among the most consistent host responses associated with cancer, and these two pathways interrelate with blood coagulation and fibrinolysis influencing tumor angiogenesis directly, thereby contributing to tumor growth. Since the tumor survival depends on blood supplement it has inspired many researchers to search for anti-angiogenic factors and to draw anti-angiogenic strategies for cancer treatment. The plasma kallikrein-kinin system is related to vascular biology and interacts with many physiologic processes such as coagulation, fibrinolysis, complement and renin-angiotensin, it regulates local blood pressure by bradykinin release (BK) and has both anti-thrombotic and pro-fibrinolitic activities. High molecular weight kininogen (HK) plays two roles in angiogenesis process, because BK promotes angiogenesis and kinin free HK (HKa) inhibits angiogenesis. Heparan sulfate proteoglycans (HSPG) may act as structural constituents of extracellular matrix, and those HSPG on cell surface may participate on processes such as endocytosis and vesicular uptake, regulating molecule traffic inside and outside cellular compartments. Different vesicles contribute on endocytosis depending on cell type and environment conditions of growth. The signaling pathways regulate all cell processes activities. The effectors in the pathways include transcription factors that control gene expression, the regulation of secretion apparatus, the metabolic enzymes, the structural and motor elements on cytoskeleton, the cell surface receptors, the cell cycle regulating proteins and membrane ionic channels. Some signaling pathways converge on all these effectors systems. The integration of different signals determine cell behavior, for instance, if cell secretes, moves, growths, proliferates and differentiates. The aim of the present study was analyze the HK interaction with surface of epithelial cells from human breast and CHO. The specific objectives in our work were to study the possibility of HK endocytosis, its processing and activity, in non-metastatic comparing to metastatic cells. In both CHO-K1 and CHO-745 cell lines we confirmed that HSPG plays role in ATP dependent and caveolae mediated endocytosis driven to endosomes the HK assembled on cell surface; we verified kinin release activities of both serine and cysteine proteases on cell surface in pH 7,35 of both cells lines CHO-K1 and CHO-745; both BK and HSPG are important in HK endocytosis; in both cells lines, and absence of Zn2+ and presence of 2% or 10% serum in medium, HKa has proliferative action, and glycosaminoglycans influence in HK activity on CHO-K1 proliferation. Both HK and HKa interactions were evaluated in mammary epithelium cells with different degrees of metastasis. The MCF-10A (non metastatic) interact more with both HK and HKa comparing to other two tumor cells, probably because their higher chondroitin sulfate content in tumor cells surface; the ratio between BK release in medium/BK internalized is higher in MDA-MB-231 cells (high degree of metastasis). In the absence of Zn2+ and presence of serum 2% or 10% in medium, within 24 h, HKa increased the proliferation of both MCF-10A and MCF-7 (middle metastatic) cells, and within 48 h the proliferation decreased in MCF-7 cells; in MDA-MB-231 both HK and HKa decreased cell proliferation and the presence of the serum changes the effect of both in 24 h, in 48 h only HK decreased cell proliferation in the presence of serum 2%. In MCF-7 Akt expression increased compared to non treated cells (control), except in cells treated with HKa in 48 h, ERK1/2 was detected in all conditions tested and c-Myc expression increased compared to non treated cells (control); in MDA-MB-231, HK or its fragments, and HKa increased Akt expression in 24 h; although p-38 is present in these cells in all conditions, HK or its fragments, and HKa promoted changes in p-38 expression, in similar manner in the presence of serum 2% or 10% in medium. The MDA-MD-231 cells migrated after in incubation with either HK or HKa in medium containing 2% or 10% serum and absence of zinc. The present study confirms the HSPG participation in cellular uptake of HK/HKa assembled on cell surface and fused with endosomes; the enzyme action of both serine and cysteine proteases classes in kinin release in incubation buffer in pH 7,35; the importance of both BK and HSPG in HK endocytosis; the involvement of caveolae in this process, and suggests the importance of zinc ions in proliferation processes related to uPAR or suPAR participation. Future studies on cell signaling may help in evaluation of cell cycle under HK/HKa treatment.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Papel do sindecam-4 no remodelamento da matriz extracelular em células endoteliais resistentes ao anoikis
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-03-29) Sousa Onyeisi, Jessica Oyie [UNIFESP]; Lopes de Azevedo, Carla Cristina [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/0546695375822929
    Objetivo: Estudar o papel do sindecam-4 no remodelamento da matriz extracelular e esclarecer suas interações com outras moléculas. Métodos: Células endoteliais de aorta de coelho resistentes ao anoikis submetidas ao silenciamento gênico do sindecam-4 (miR-Syn4-Adh-1-EC) foram estudadas comparando-se com células endoteliais de aorta de coelho resistentes ao anoikis parentais (Adh-EC), células endoteliais de aorta de coelho selvagens (EC) e células endoteliais de aorta de coelho transfectadas com o oncogene EJ-ras (EJ-ras EC), em relação a: migração celular, angiogênese, biossíntese de glicosaminoglicanos sulfatados ao longo do ciclo celular, localização, expressão gênica e proteica das macromoléculas da MEC e das enzimas responsáveis pela degradação da MEC. Foi avaliada ainda a atividade das MMPs, a expressão dos TIMPs e da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), bem como a produção de óxido nítrico (NO). A expressão gênica e proteica dos receptores de superfície celular (integrinas α5β1 e αVβ3) e das moléculas de sinalização celular: quinase de adesão focal (FAK) e SRC também foram analisadas. A migração celular foi avaliada pelo ensaio wound healing, a expressão gênica foi avaliada através da técnica de qPCR, a expressão e localização proteica através das técnicas de western blotting e imunofluorescência, respectivamente, a atividade das MMPs foi avaliada pela técnica de zimografia e a produção de NO foi avaliada pela reação de GREISS. Resultados: O silenciamento SDC4 levou à uma diminuição da migração e da capacidade angiogênica das células endoteliais resistentes ao anoikis. Em comparação com as células parentais (Adh1-EC), as células silenciadas SDC4 (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC) exibiram um aumento na adesão celular à fibronectina. Além disso, a transfecção com miRNA-SDC4 levou a aumento na síntese de heparam sulfato após 12 horas de estímulo com soro fetal bovino (SFB). Após o silenciamento do SDC4, também observamos um aumento na expressão da fibronectina e do colágeno IV e uma diminuição na expressão das integrinas α5β1 e αVβ3. Além disso, as células silenciadas para o SDC4 apresentam um aumento na expressão de Src e FAK. Em relação à expressão das enzimas responsáveis pela degradação da MEC e seus reguladores, nós observamos uma diminuição na expressão da HPSE, da MMP2 e do TIMP2 após o silenciamento do SDC4. Também observamos que o silenciamento do SDC4 causou uma diminuição na produção de óxido nítrico e na expressão de eNOS. Conclusão: Os resultados apresentados ao longo do presente trabalho sugerem que o SDC4 tem um papel importante no remodelamento da matriz extracelular e também representam um passo importante para a compreensão do mecanismo pelo qual o SDC4 pode reverter o fenótipo transformado das células endoteliais resistentes ao anoikis.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Papel dos glicosaminoglicanos da família da heparina na indução e estabilização de fibras β-amilóides derivadas da enzima proteolítica HTRA1
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-09-13) Braga, Luiz Fernando Patekoski [UNIFESP]; Tersariol, Ivarne Luis dos Santos [UNIFESP]; Lima, Marcelo Andrade; http://lattes.cnpq.br/2373620610058306; http://lattes.cnpq.br/4859954582615304; http://lattes.cnpq.br/1997933486455894
    [Introdução] A serinoprotease HTRA1 é um homotrímero formada por três cadeias polipeptídicas idênticas, essa enzima é capaz de degradar várias proteínas da matriz extracelular, tais como a fibronectina, os proteoglicanos agrecam, decorim, fibromodulina, bem como, regular a disponibilidade dos fatores de crescimento da família dos FGF, IGF e TGF-β, para a sinalização celular. Essa protease está envolvida em várias neuropatias, como na degeneração macular associada a idade (ARMD7), na distrofia corneana, em neuropatias hereditárias cerebrovasculares (CARASIL e CADASIL) e Alzheimer. Dentre os diversos glicosaminoglicanos (GAGs), a heparina é um potente indutor da formação de fibras β-amilóides em várias proteínas [Objetivos]. Os principais objetivos deste trabalho foram trabalho verificar a capacidade da enzima HTRA1 de se polimerizar e fibras β-amilóides, bem como, a capacidade dos GAGs, em especial da heparina, de interagir com a enzima HTRA1 e promover a indução e a estabilização aa polimerização da enzima HTRA1 recombinante. [Métodos] dessa forma, clonamos e expressamos em E. coli três isoformas recombinantes da enzima HTRA1: a enzima selvagem, a enzima inativa, mutante de sítio ativo S328A e a enzima defectiva do domínio PDZ (ΔPDZ). Verificamos por diferentes técnicas biofísicas e bioquímicas o impacto da interação molecular da heparina e de outros GAGs na estrutura tridimensional e na atividade catalítica da enzima HTRA1. A atividade catalítica das formas recombinantes da enzima HTRA1 foram monitoradas por espectrofluorimetria com o auxílio do substrato fluorescente do tipo FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), MCA-IRRVSYSF(K-Dnp)K. A polimerização dos monômeros da enzima HTRA1, bem como, a polimerização induzida por GAGs foi monitorada por DLS (Dynamic Light Scattering), SDS-PAGE, espectrofluorimetria, espectrometria de massa, coloração com Congo Red e por microscopia eletrônica de varredura. [Resultados] A heparina se mostrou um potente inibidor da atividade proteolítica da HTRA1, a heparina interage com maior afinidade na enzima livre (Ki = 85 ± 9 nM) do que no complexo enzima-substrato (αKi = 246 ± 34 nM); porém a ligação da heparina na enzima livre impede a ligação do substrato no sítio ativo. Esses resultados indicam que a heparina é um inibidor do tipo misto. Os nossos resultados também mostraram que o domínio PDZ controla alostericamente a ligação da heparina. A heparina interage tanto com o domínio catalítico da enzima HTRA1, bem como com seu domínio PDZ. A interação da heparina com o domínio PDZ da HTRA1 é capaz de estabilizar a forma homotrimérica da enzima, além de induzir a sua polimerização e a formação de fibras β-amilóides nessa proteína. Também foi observado por espectroscopia de CD e por espectrofluorimetria intrínseca que a heparina é capaz de promover alterações conformacionais na enzima HTRA1, induzindo tanto a formação de estruturas β-antiparalelas quanto a formação de fibras β-amilóides. Dentre os diversos GAGs estudados, nominalmente: heparina, condroitim-4 e 6-sulfato, dermatam-sulfato e ácido hialurônico, somente a o ácido hialurônico não foi capaz de induzir a formação de agregados amiloidogênicos na enzima HTRA1, essa indução é dependente da organização espacial das cargas negativas dos grupamentos sulfatos e carboxílicos desses polissacarídeos. A capacidade de indução dos agregados amilóides pela heparina é dependente do domínio PDZ da enzima, bem como, não depende da capacidade proteolítica da HTRA1, nem da capacidade inibitória da heparina. Observamos, também, que a formação de agregados proteicos da HTRA1 é dependente da força iônica do meio (≤ 160 mM) e da concentração da HTRA1 em solução. A enzima HTRA1 se autopolimeriza em concentrações ≥ 2.0 µM (pH 7.4) em força iônica = 0,15 M. Os dados obtidos por Microscopia Eletrônica de Varredura mostraram que a heparina induz a formação de estruturas fibrilares a partir de agregados esferoides de 40 nm. Os ensaios de espectroscopia UV-Vis da interação da HTRA1 com o corante Congo Red mostraram que os agregados de HTRA1 observados pela técnica de DLS são, de fato, fibras β-amilóides. [Conclusão]. A heparina é um potente inibidor da atividade proteolítica da HTRA1 (KI = 85 ± 9 nM). A HTRA1 é capaz de autopolimeriza, espontaneamente, formando fibras β-amilóides, em concentrações ≥ 2 µM em pH e força iônica fisiológicos. Os GAGs da família da heparina induzem e estabilizam essa polimerização. Esses resultados podem ser translacionados para as doenças neurológicas hereditárias ou adquiridas onde a enzima HTRA1 está sabidamente envolvida, na degeneração macular associada a idade (ARMD7), na distrofia corneana, em neuropatias hereditárias cerebrovasculares (CARASIL e CADASIL) e Alzheimer.
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    Acesso aberto (Open Access)
    O papel dos glicosaminoglicanos no controle do estresse nitrosativo do retículo endoplasmático
    (Universidade Federal de São Paulo, 2021-12-02) Correa, Talita; Tersariol, Ivarne Luis dos Santos [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4859954582615304; http://lattes.cnpq.br/7788275702179211
    Introdução. Nosso grupo tem investigado o papel dos glicosaminoglicanos (GAGs) na regulação da atividade da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Verificamos que naturalmente os GAGs controlam a ativação da eNOS, no sítio regulatório positivo Ser1177, por inibir a sinalização celular mediada pelo eixo integrina/FAK/PI3K/AKT/eNOS, bem como, por favorecer a ativação da PKCα na caveolae, que leva a fosforilação da eNOS no sítio regulatório negativo Thr495, resultando em maior inibição da produção de NO nas células CHO-K1 selvagens. Nas células mutantes CHO-745, defectivas na biossíntese de GAGs, a ausência de glicosaminoglicanos na superfície celular dessas células mutantes leva uma ativação permanente da eNOS, por aumento da fosforilação no sítio regulatório positivo Ser1177, bem como, uma grande diminuição da fosforilação no sítio regulatório negativo Trh495. O NO é um segundo mensageiro que controla a expressão de vários genes relacionados ao metabolismo das espécies nitrosativas/oxidativas, a biogênese mitocondrial e ao metabolismo de cálcio. Dados da literatura mostram que o NO ocasiona o estresse nitrosativo do retículo endoplasmático (RE). Variações no nível citosólico de cálcio, a inibição da glicosilação de proteínas N-ligadas, o estresse nitrosativo/oxidativo, entre outros fatores, podem levar ao estresse do RE, o qual dispara vias de sinalização específicas incluindo a Unfolded Protein Response (UPR). A UPR promove aumento na expressão de chaperonas, inibição da tradução de novas proteínas e aumento da degradação de proteínas mal-enoveladas e apoptose. Objetivo. Investigar a indução do estresse do RE nas células CHO-K1 selvagens e no seu mutante CHO-745. Métodos. Estudos de mobilização de Ca2+ por ação do agonista UDP do receptor P2Y6, bem como, pelo bloqueio da enzima Ca2+-ATPase do RE pela ação da tapsigargina. Estudos do transiente citoplasmático de Ca2+ por microfluorimetria, na presença de doadores de NO (GSNO) ou na presença de bloqueadores da síntese de NO (L-NAME). Análise da expressão do receptor P2Y6 por citometria de fluxo, análise da expressão gênica da proteína NCX1 por RT-PCR e por western-blotting. Análise do tráfego intracelular da enzima catepsina B, residente da rota secretória (RE/ Golgi/ Lisossomos), por microscopia confocal de fluorescência xv nas células CHO. Estudo da viabilidade celular pelo teste de MTT das linhagens CHO, na ausência ou na presença de substâncias indutoras do estresse do RE, como a tapsigargina e a tunicamicina. Análise da expressão gênica das proteínas sinalizadoras da via do estresse do RE: PERK, IRE1α e CHOP por Western blotting nas células CHO, na presença ou na ausência de doador de NO. Resultados. As células CHO-745 mobilizam cerca de 40% menos de Ca2+ do RE para o citosol do que as células CHO-K1. Na presença do inibidor da síntese de NO, L-NAME, a resposta da fluorescência para a mobilização de cálcio do RE induzida pelo UDP é máxima (Emax= 417 ± 24 RFU), enquanto na presença de indutores da síntese de NO, a resposta a mobilização de cálcio do RE induzida pelo UDP é mínima (Emax= 162 ± 10 RFU). A célula mutante CHO-745 expressa cerca de 2,6 vezes mais a isoforma da proteína NCX1 do que as células selvagens CHO-K1. A análise das imagens obtidas por microscopia confocal mostrou que a calreticulina, chaperona e proteína tampão de Ca2+ do RE, nas células CHO-745 é cerca de 2,5 vezes mais expressa do que nas células CHO-K1. A enzima catepsina B está menos presente no RE das células CHO-K1 (37 ± 3%) do que nas células CHO-745 (85 ± 6 %), sugerindo que essa enzima lisossomal está acumulada no RE das células CHO-745. As células CHO-745 são cerca de 2 vezes mais resistentes a morte celular disparada por tapsigargina ou pela tunicamicina do que as células CHO-K1. Verificamos que a enzima PERK está cerca de 1,7 vezes mais expressa e 3 vezes mais fosforilada nas células CHO-745 do que nas células CHO-K1, sua expressão é ativada por NO. A proteína IRE1α está 2 vezes mais processada proteolíticamente nas células CHO-745, sua expressão e processamento proteolítico são controlados por NO. Por fim, a proteína CHOP está cerca de 1,6 vezes mais expressa nas células CHO-745 do que nas células CHO-K1. Conclusão. Para sobreviver ao maior nível de estresse nitrosativo, as células CHO-745 tiveram que se adaptar. Nossos resultados mostram que a diminuição da concentração citosólica de cálcio, a elevação da expressão gênica de PERK, de sua maior fosforilação, bem como, a diminuição da quantidade efetiva de IRE1α pelo aumento de sua proteólise fazem parte deste mecanismo adaptativo ao estresse de retículo endoplasmático induzido pelo NO.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Terapia de reposição da enzima alfa-L-iduronidase recombinante em pacientes portadores de mucopolissacaridose do tipo I: análise de glicosaminoglicanos urinários e correlações clínicas
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2009) Braghiroli, Patricia Santos [UNIFESP]; Toma, Leny [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease caused by deficiency of -L-iduronidase, which cleaves terminal iduronic acid residues of glycosaminoglycans (GAGs), heparan sulphate (HS) and dermatan sulphate (DS). Impairment of degradation leads to its accumulation and increased urinary excretion, with a wide spectrum of clinical severity. The aim of this work was to evaluate the effects of periodic enzyme replacement therapy (ERT) with recombinant -L-iduronidase in MPS I patients. Three patients were weekly treated with Laronidase (Aldurazyme®), 0,58 mg/kg intravenously. Clinical evaluation and analysis of urinary GAGs were done before and after ERT. Two clinically severe Hurler and one mild Hurler-Scheie patients were enrolled in this study. After 19 to 22 months of treatment, the effects observed herein are in accordance with previous data, showing efficacy of ERT on reducing hepatosplenomegaly and clinical improvements, without changing mental impairment of the Hurler patients. Remarkably were the findings of decreasing DS excretion for all patients, the value not returning to the initial baseline. One exception was for the Hurler- Scheie patient who presented a peak of higher values after 11 months of infusion after interruption of treatment, followed by important decrease after return to ERT. Noteworthy was the case of this same patient, whose DS decreased, whereas a progressive increase of CS was observed. Although CS is not present in MPS I urine, it is the predominant GAG in normal individuals. ERT may not be a cure for these diseases and improvement cannot reach all the tissues and affected organs, but represents a safe alternative choice of treatment while gene therapy is not available for humans.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Terapia de reposição enzimática para as mucopolissacaridoses I, II e VI: recomendações de um grupo de especialistas brasileiros
    (Associação Médica Brasileira, 2010-01-01) Giugliani, Roberto; Federhen, Andressa; Munoz Rojas, Maria Verônica; Vieira, Taiane Alves; Artigalás, Osvaldo; Pinto, Louise Lapagesse Carmargo; Azevedo, Ana Cecília; Acosta, Angelina Xavier; Bomfim, Carmem; Lourenço, Charles Marques; Kim, Chong Ae; Horovitz, Dafne; Souza, Denize Bomfim; Norato, Denise; Marinho, Diane; Palhares, Durval; Santos, Emerson Santana; Ribeiro, Erlane; Valadares, Eugênia Ribeiro; Guarany, Fábio; De Lucca, Gisele Rosone; Pimentel, Helena; Souza, Isabel Neves de; Corrêa Neto, Jordão [UNIFESP]; Fraga, José Carlos; Góes, José Eduardo; Cabral, José Maria; Simeonato, José; Llerena Junior, Juan Clinton; Jardim, Laura Bannach; Giuliani, Liane De Rosso; Silva, Luiz Carlos Santana da; Santos, Mara; Moreira, Maria Ângela; Kerstenetzky, Marcelo; Ribeiro, Márcia; Ruas, Nicole; Barrios, Patricia; Aranda, Paulo; Honjo, Rachel; Boy, Raquel; Costa, Ronaldo; Souza, Carolina Fishinger Moura de; Alcântara, Flavio F; Avilla, Sylvio Gilberto A; Fagondes, Simone; Martins, Ana Maria [UNIFESP]; Universidade Federal do Rio Grande do Sul Departamento de Genética; Instituto Nacional de Genética Médica Populacional Centro Colaborador da OMS para o Desenvolvimento de Serviços de Genética Médica na América Latina e Coordenador; Hospital das Clínicas de Porto Alegre Grupo de Pesquisa Clínica em Genética Médica; Universidade Federal do Rio Grande do Sul Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente; Grupo Hospitalar Conceição; Prefeitura Municipal de Gravataí; Universidade Federal da Bahia Departamento de Pediatria; Universidade Federal do Paraná Hospital de Clínicas Serviço de Transplante de Medula Óssea; Universidade de São Paulo (USP); FIOCRUZ Instituto Fernandes Figueira Centro de Genética Médica; Hospital Universitário; PUC Faculdade de Medicina; Hospital de Clínicas de Porto Alegre Serviço de Oftalmologia; Universidade Federal do Mato Grosso do Sul Departamento de Pediatria; Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas; Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte; Universidade Federal de Minas Gerais Departamento de Pediatria; Hospital de Clínicas de Porto Alegre Serviço de Fisiatria; Hospital Infantil Joana de Gusmão; APAE; Universidade Federal do Pará; Hospital do Servidor Público Estadual; Universidade Federal do Rio Grande do Sul Departamento de Cirurgia; Universidade Federal do Amazonas Departamento de Cirurgia; Hospital Infantil; Universidade Federal do Rio Grande do Sul Departamento de Medicina Interna; Universidade Federal do Pará Instituto de Ciências Biológicas; Hospital Infantil Pequeno Príncipe; Hospital de Clínicas de Porto Alegre Serviço de Pneumologia; Hospital da Restauração; Universidade Federal do Rio de Janeiro Departamento de Pediatria; Hospital de Clínicas de Porto Alegre; Hospital de Clínicas de Porto Alegre Serviço de Cardiologia; Hospital Evangélico; Universidade Estadual do Rio de Janeiro; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Mucopolysaccharidoses (MPS) are rare genetic diseases caused by deficiency of specific lysosomal enzymes that affect catabolism of glycosaminoglycans (GAG). Accumulation of GAG in various organs and tissues in MPS patients results in a series of signs and symptoms, producing a multisystemic condition affecting bones and joints, the respiratory and cardiovascular systems and many other organs and tissues, including in some cases, cognitive performance. So far, eleven enzyme defects that cause seven different types of MPS have been identified. Before introduction of therapies to restore deficient enzyme activity, treatment of MPS focused primnarily on prevention and care of complications, still a very important aspect in the management of these patients. In the 80's treatment of MPS with bone marrow transplantation/hematopoietic stem cells transplantation (BMT/HSCT) was proposed and in the 90's, enzyme replacement therapy (ERT),began to be developed and was approved for clinical use in MPS I, II and VI in the first decade of the 21st century. The authors of this paper are convinced that a better future for patients affected by mucopolysaccharidoses depends upon identifying, understanding and appropriately managing the multisystemic manifestations of these diseases. This includes the provision of support measures (which should be part of regular multidisciplinary care of these patients) and of specific therapies. Although inhibition of synthesis of GAG and the recovery of enzyme activity with small molecules also may play a role in the management of MPS, the breakthrough is the currently available intravenous ERT. ERT radically changed the setting for treatment of mucopolysaccharidosis I, II and VI in the last decade., Benefits can even be extended soon to MPS IV A (ERT for this condition is already in clinical development), with prediction for treatment of MPS III A and the cognitive deficit in MPS II by administration of the enzyme directly into the central nervous system (CNS). A large number of Brazilian services, from all regions of the country, already have experience with ERT for MPS I, II and VI. This experience was gained not only by treating patients but also with the participation of some groups in clinical trials involving ERT for these conditions. Summing up the three types of MPS, more than 250 patients have already been treated with ERT in Brazil. The experience of professionals coupled to the data available in international literature, allowed us to elaborate this document, produced with the goal of bringing together and harmonize the information available for the treatment of these severe and progressive diseases, which, fortunately, are now treatable, a situation which bring new perspectives for Brazilian patients, affected by these conditions.