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    Alterações em células de tumor de mama MCF-7 após superexpressão da enzima heparanase-1
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-07) Silva, Mariane Barros Ribeiro da [UNIFESP]; Pinhal, Maria Aparecida da Silva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7511274763693292; http://lattes.cnpq.br/2778388041557973
    Introdução: A enzima heparanase-1 (HPSE1) é uma endo-β-glucuronidase que cliva cadeias de heparam sulfato (HS) e heparina e está diretamente relacionada com a carcinogênese. Objetivo: O objetivo do estudo foi avaliar como a superexpressão de HPSE1 pode promover alterações moleculares em células de tumor de mama humano do subtipo molecular luminal A (MCF-7). Métodos: Células MCF-7 foram estavelmente transfectadas com o cDNA de HPSE1 e a avaliação da expressão de receptores específicos, bem como dos diferentes proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) foi realizada por ensaios de RT-PCR quantitativo, microscopia confocal e citometria de fluxo. A atividade enzimática de HPSE1 foi determinada por degradação de heparam sulfato biotinilado. A quantificação de ácido hialurônico (AH) foi determinada por ensaio de Elisa-like. A identificação e quantificação dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) foi realizada por marcação com [35S]-sulfato. A estrutura do HS foi determinada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). A proliferação celular foi obtida por incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU). O ensaio de clonogenicidade foi realizado para a determinação da capacidade de formação de colônias. A viabilidade celular e o perfil de exossomos foram avaliados após tratamento com os quimioterápicos Fauldoxo, Paclitaxel e Fauldcispla. Resultados: Os resultados mostraram que a superexpressão de HPSE1 altera a expressão de isoformas do receptor CD44 e aumenta a expressão de HER2, porém não afeta o padrão de proliferação celular e capacidade de formação de colônias. Houve alteração do perfil de GAG, estrutura do HS, bem como aumento da expressão das enzimas que participam da biossíntese de HS, após superexpressão de HPSE1. Os dados também evidenciaram aumento significativo dos PGHS, sindecam-2, sindecam-3 e sindecam-4 e diminuição de sindecam-1 em células tranfectadas com HPSE. Análises in sílico e in vitro mostraram correlação direta entre o nível de expressão de sindecam3 e do fator indutor de hipóxia (HIF-1α) com HPSE1. Conclusão: Os resultados revelam inúmeras alterações do perfil de expressão de moléculas cruciais envolvidas na carcinogênese, indica possível utilização de HPSE1 como um marcador adicional no diagnóstico do câncer de mama auxiliando também no desenvolvimento de potencial terapias alvo.
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    Análise de microRNAs exossomais como potenciais biomarcadores precoces da Lesão Renal Aguda induzida por lipopolissacarídeo em ratos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2019-09-26) Silva, Carolina Carvalho Serres Da [UNIFESP]; Boim, Mirian Aparecida [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8916858915652849; http://lattes.cnpq.br/9510389234856610; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Acute kidney injury (AKI) consists of the abrupt reduction of the glomerular filtration rate evidenced by increased serum creatinine and/or reduced urine output, compromising the electrolyte balance and the clearance of nitrogenous slags. The cause is multifactorial, and sepsis contributes to the high prevalence of AKI. It is known that the development and the delay in the identification of AKI is a risk factor for chronicity. In this way, its early detection is essential for trigger proper treatment strategies at a more opportune moment. Serum creatinine is not an optimal marker of renal dysfunction, since the elevation is detected late during AKI onset. microRNAs (miRs), a class of non-coding RNAs responsible for gene regulation, may be promising tools for the early detection of AKI. This class of molecules can be found in biological fluids within vesicles such as exosomes and microvesicles. Aim: To evaluate potential miRs that can be used as early biomarkers in sepsis-induced AKI. Methods: Male Wistar rats at 12 weeks of age undergoing intraperitoneal administration of lipopolysaccharides (LPS) at a dose of 7.5 mg/kg were used. Renal function was initially assessed by serum creatinine, with change detected 4 hr after LPS administration. In order to evaluate whether miRs could act as earlier biomarkers, blood samples were collected before and 2 hr after LPS infusion, and therefore before creatinine elevation. Exosomes in the serum were isolated and the total miRs were extracted for evaluation of the gene expression profile by the array PCR technique. Results: miR-181a-5p and miR-23b-3p showed higher expression in LPS-treated rats compared to the control animals (p<0.05). Bioinformatic studies showed that both miRs target molecules associated with carcinogenesis and to transcription factors that regulate genes related to proinflammatory cytokines. Conclusion: Considering that LPS activates transcription factors, leading to the production of proinflammatory cytokines, possible premature changes in serum levels of miR-181a-5p and miR-23b-3p may be able define earlier the sepsis-induced AKI.
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    Busca por miRNAs provenientes de exossomos relevantes para epileptogênese
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022) Rueda, Beatriz Enguidanos Villena [UNIFESP]; Belangero, Síntia Iole Nogueira [UNIFESP]; Kuniyoshi, Vanessa Kiyomi Ota [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9370282416280620; http://lattes.cnpq.br/2623781262478620; http://lattes.cnpq.br/3013098793487837
    O Traumatismo Cranioencefálico (TCE) é altamente frequente no Brasil, ocorrendo mais de 150 mil casos por ano, e é um grande fator de risco para o desenvolvimento de epilepsia pós-traumática (EPT). Contudo, o tratamento de EPT derivado de TCE ainda é pouco eficaz. Portanto, é necessário investigar novas abordagens, como o uso do biperideno, um medicamento anticolinérgico. MicroRNAs (miRNAs) provenientes de vesículas extracelulares (VEs) podem auxiliar na compreensão das bases biológicas da EPT, uma vez que regulam a expressão gênica e podem ser detectados perifericamente. As VEs são liberadas por vários tipos celulares, como células neurais, e são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica. O principal objetivo desse estudo foi identificar padrões de alterações nos níveis de miRNAs carreados por VEs após TCE, que possam estar relacionados com o desenvolvimento de EPT e/ou que estejam relacionados com o tratamento com biperideno. Os objetivos específicos, foram: a) encontrar miRNAs associados à EPT, ao comparar o grupo dos indivíduos que desenvolveram com o dos que não desenvolveram a EPT; b) buscar miRNAs relacionados ao tratamento, ao comparar o grupo dos indivíduos que tomaram placebo com o dos que receberam biperideno; e c) identificar os genes alvo dos miRNAs diferencialmente expressos e as suas vias biológicas enriquecidas na epileptogênese e no tratamento com biperideno. A coleta dos participantes do estudo fez parte de um projeto temático que incluiu um ensaio clínico duplo-cego e randomizado. Foram incluídos 37 indivíduos que sofreram TCE, sendo que a coleta de sangue foi realizada após 10 dias do trauma e do início do tratamento (biperideno ou placebo). Desses 37, 18 receberam biperideno e 19 receberam placebo, e ao todo cinco indivíduos desenvolveram EPT. Primeiramente, foi realizado o isolamento de VEs provenientes do soro, sendo uma parte utilizada para a sua caracterização, de acordo com o seu tamanho e a presença de proteínas de membrana. A outra parte foi utilizada para a extração de miRNAs seguido do preparo de bibliotecas para o sequenciamento de nova geração do miRNoma (conjunto de miRNAs). A análise de expressão diferencial desses miRNAs foi realizada com o auxílio de ferramentas de bioinformática. Em relação aos miRNAs associados com o tratamento, o miR-9-5p (p ajustado < 0,05) apresentou uma expressão diminuída em pacientes que tomaram biperideno. A análise de vias para os alvos desse miRNA mostrou um enriquecimento para a via de ciclo de vesículas sinápticas. O miRNA miR-17-5p, que encontramos com a expressão aumentada em pacientes que tomaram biperideno (p < 0,01), tem como alvos genes das vias de morfogênese dendrítica, regulação da neurogênese e desenvolvimento de axônios. Na análise de miRNAs associados a EPT, embora nenhum tenha sido associado após a correção para múltiplas comparações, destacamos o miR-144-3p, que foi encontrado com uma expressão aumentada em pacientes que desenvolveram EPT (p < 0,01). Os alvos desse miRNA estão enriquecidos para as vias de regulação do desenvolvimento da projeção neuronal, axonogênese e regulação da organização sináptica. Os resultados das vias biológicas encontradas como enriquecidas para os alvos desses três miRNAs diferencialmente expressos corroboram estudos da literatura, sendo esses miRNAs associados com processos neuroprotetores e/ou neurodegenerativos. Dessa forma, concluímos que miRNAs expressos em VEs podem ser potenciais marcadores de risco para a EPT, bem como interagir com o biperideno na prevenção dela, auxiliando no melhor prognóstico de indivíduos que sofreram TCE.
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    Comparação dos efeitos de célulastronco e de suas vesículas extracelulares no tratamento de lesão renal induzida por estenose crônica da artéria renal
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2018-06-29) Silva, Crysthiane Saveriano Rubiao [UNIFESP]; Boim, Mirian Aparecida [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8916858915652849; http://lattes.cnpq.br/0641977969150187
    Chronic renal artery stenosis is considered one of the most frequent causes of renovascular hypertension (RH), which can lead to irreversible renal tissue damage and deterioration of renal function. In this project we used the experimental model of partial stenosis of the renal artery known as 2 kidneys 1 clip model (2K1C) to induce RH and chronic renal hypoxia. Faced with limited treatment alternatives and reduced angiogenic and regenerative ability of the kidneys, stem cells appear as a promising alternative therapy for chronic renal ischemia. Previous studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from bone marrow have produced significant beneficial effects on the 2K1C model through paracrine effects, stimulating angiogenesis and immunomodulation. Recent evidence indicates that MSC conditioned medium containing extracellular vesicles (EV), including microvesicles (MV) and exosomes (EX) released by MSC have therapeutic effects similar to MSCs. Therefore, the aim of this study was to investigate and compare the effects of MSC obtained from adipose tissue and MV and EX on tissue regeneration in the 2K1C model. Methods: MSCs were obtained from white adipose tissue (ASC) of Wistar rats and were characterized according to their immunophenotype and multipotentiality. Extracellular vesicles (EV) were isolated from the ASC culture medium and sizeseparated in MV and EX by ultracentrifugation. Vesicles were identified by nanoparticles tracking using Nanosight and analyzed by the presence of specific markers for each type of EV by western blotting. Male Wistar rats were divided into five groups: 1Sham Group; 2Stenotic Group; 3Stenotic Group + ASCs; 4Stenotic Group + MV; 5Stenotic Group + EX. The ASC, MV and EX were infused through the tail vein at the 3rd and 5th weeks after clamping. Systolic blood pressure (SBP) was monitored weekly. After six weeks, 24hour urine and blood were collected for biochemical analyzes. Kidneys were removed for molecular biology analysis. Gene expression was verified by quantitative realtime PCR and analyzed using the following markers: Collagen type I (Col I), TGFβ, HIF1α SDF1α, IL1β and IL10 in the renal cortex and medulla. Results: Flow cytometry analysis showed that after 48 hours the ASCs were retained mainly in the stenotic and contralateral kidneys followed by lungs and heart. After 15 days the presence of ASC decreased significantly in the lungs but was still present in both kidneys. The stenotic animals showed a progressive increase in SBP while the groups treated with ASC, MV and EX showed a stabilization of PAS in similar degrees between the different treatments. Plasma creatinine was similar between groups, however, the stenotic animals developed proteinuria which was reduced by treatment with ASC and MV an effect not observed in the EX treated group. There was an increase in the expression of Col I and TGFβ in the stenotic and contralateral kidney (cortex and medulla) which was reduced by the treatment with ASC, MV and EX. ASCtreated animals showed a significant increase in expression of the stem cells homing marker (SDF1α) in the cortex and medulla in the stenotic and contralateral kidney, the MV and EX treated groups also showed an smaller increase in the expression of SDF1α in both kidneys. The hypoxia marker (HIF1α) presented an increase in the stenotic kidney and the treatments with ASC, MV and EX were efficient in reducing this marker. There was an increase of the proinflammatory cytokine IL1β in both kidneys of the hypertensive animals being efficiently reduced in both kidneys mainly by the ASC treated group and the treatments with ASCs, MV and EX was able to induce an increase the antiinflammatory cytokine IL10. In conclusion, the results suggest that the EV released by ASC produced good results, but with lower efficiency in some parameters when compared to ASC. The use of ASCs has produced more effective effects in this model of chronic hypoxia and the use of EV in replacement to cells should be evaluated depending on the parameter to be corrected.
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    Identificação de miRNAs em exossomos e seu papel na agressividade do melanoma
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-13) Marangoni, Nayane Lopes [UNIFESP]; Jasiulionis, Miriam Galvonas [UNIFESP]; Perestrelo, Bruna de Oliveira [UNIFESP]; http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K8105074H6; http://lattes.cnpq.br/3057188718614807; http://lattes.cnpq.br/3655682330286887
    O melanoma é considerado o câncer de pele mais agressivo devido a sua alta capacidade metastática e resistência às terapias. Alterações tanto genéticas quanto epigenéticas têm papel na progressão desse tumor, sendo crucial a participação de mecanismos epigenéticos na regulação da mudança de fenótipos observada em melanomas. Entre as alterações epigenéticas que contribuem com o desenvolvimento do melanoma estão aquelas que envolvem RNA não codificantes (ncRNAs), como os miRNAs. A ampla regulação da expressão gênica por miRNAs, implica na repressão traducional ou degradação de mRNAs, influenciando processos fisiológicos como proliferação celular, diferenciação, angiogênese e apoptose. O conhecimento acerca dos miRNAs ganhou nova perspectiva com a descoberta de que esses pequenos ncRNAs não se restringem ao citoplasma das células, mas podem ser liberados no meio extracelular em pequenas vesículas extracelulares (sEVs), incluindo exossomos. Os exossomos tumorais desempenham um papel crucial na progressão tumoral, influenciando a função das células receptoras por meio da transferência de conteúdo exossomal. Os efeitos dessa influência dependem do tipo e composição molecular dos exossomos, determinados pela célula de origem. Essa comunicação celular está associada à sinalização intercelular no microambiente tumoral, resultando no enriquecimento de fatores pró-metastáticos e pró-tumorais. Diante disso, miRNAs exossomais estão sendo estudados quanto ao potencial uso como biomarcadores, seu valor prognóstico e sua interferência em vias relacionadas à progressão do melanoma. A partir da utilização de um modelo celular linear de progressão do melanoma estabelecido em nosso laboratório, foi realizado o sequenciamento de pequenos RNAs (Small RNA-seq) contidos em exossomos liberadas por células de melanoma indiferenciadas, mesenquimal-like e pouco proliferativas (4C11-) e células de melanoma pigmentadas, altamente proliferativas e metastáticas (4C11+). MiRNAs identificados como presentes nos exossomos das linhagens celulares 4C11- e 4C11+ foram selecionados considerando o conteúdo diferencial e a relevância na tumorigênese no melanoma. O presente estudo buscou elucidar um novo mecanismo baseado na transferência de miRNAs presentes em exossomos envolvidos no aumento das características de agressividade de células de melanoma. Os dados obtidos podem determinar novas estratégias terapêuticas alvejando miRNAs liberados por exossomos, visando a indução de um estado menos agressivo, além do potencial uso para o prognóstico e diagnóstico do melanoma.
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    Perfil redox sazonal e o papel do fluido folicular na maturação de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico
    (Universidade Federal de São Paulo, 2017-09-27) Rodrigues, Thais Alves [UNIFESP]; Lopes, Fabiola Freitas de Paula [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Heat stress promotes changes in reproductive microenvironment, compromising the oocyte and embryos development. High temperature alters cells redox balance. However, it is not know how the temperature affects the oocyte microenvironment as wells as the role of follicular fluid (FF) in heat-shocked oocytes. The aim of the first experiment was to determine the effect of seasonal heat stress in the activity of antioxidant enzymes, lipid peroxidation and total protein in bovine FF. Glutathione peroxidase activity was reduced in FF collected in summer compared to winter. However, there was no effect on superoxide dismutase and lipid peroxidation. There was a tendency of total protein reduction in FF in summer. In the second series of experiments, the heat stress was applied in vitro (heat shock). The aim of those experiments was to determine the role of FF in cumulus cells (CCs) expansion, nuclear maturation, protein quinase activated by mitogens (MAPK) activity, oxygen reactive species (ROS) production and developmental competence of bovine oocytes subjected to heat shock during in vitro maturation (IVM). Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from slaughterhouse ovaries and distributed to the treatments heat shock (41ºC for 14 h followed by 38.5°C for 8 h) or control (38.5ºC for 22 h) in the presence of 0, 10 or 15% FF. For CCs expansion evaluation, images before and after COCs IVM were acquired. The oocytes were stained with 5 μg/ml Hoechst 33342 to evaluate nuclear maturation. Heat shock reduced CCs expansion and nuclear maturation. However, supplementation of IVM medium with 10% FF reverted these deleterious effects. MAPK activity was determined by Western Blotting. There was no effect of heat shock or FF in oocyte MAPK activity. However, heat shock enhanced MAPK activity in CCs and 10% FF was capable of reverting this effect. Heat shock also reduced the number of cleaved oocytes and the percentage of blastocyst. However, addition of 10% FF reverted this effect. The third series of experiments determined the role of FF exosomes in CCs expansion and embryos development competence in oocytes subjected to heat shock during IVM. Exosomes were isolated by ultracentrifugation. Heat shock reduced the expansion of CCs, cleavage and blastocyst rates. However, supplementation with FF exosomes (16 x 109 particles/ml) reverted this effect. Heat shock did not affect gene expression in blastocysts. In addition, exosomes reduced expression of NANOG and enhanced the expression of SOX2, indicating that exosome supplementation accelerated the embryo development. Exosomes were uptaken by CCs and not by the oocyte, indicating that the thermoprotective effect of FF can be mediated by exosomes via CCs. In conclusion, the moderate increase in environmental temperature is capable of changing the antioxidant system in follicular fluid. In addition, exposure of oocytes to heat shock during IVM showed a negative impact in CCs expansion, nuclear maturation, MAPK activity and embryo development. However, both FF and exosomes were capable of reverting the heat stress deleterious effects.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Revisão bibliográfica sobre Linfócitos B e as Vesículas Extracelulares liberadas por essas células
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-01) Oliveira, Julia Soares [UNIFESP]; Batista, Patricia Xander [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3620553457348403
    O sistema imunológico atua na proteção e homeostasia do organismo. Linfócitos B são células especializadas na produção de anticorpos, apresentação de antígenos, produção de citocinas e geração de células de memória. Essas células podem ser classificadas em linfócitos B-1 e B-2, cada um contribuindo de maneira única para a resposta imunológica. Células B-1 são conhecidos por sua participação na produção de anticorpos naturais, apresentando características como baixa afinidade e polirreatividade. Em contraste, os linfócitos B-2 desempenham um papel essencial na resposta adaptativa, produzindo anticorpos específicos em resposta a antígenos específicos. Além do seu papel na produção de anticorpos, os linfócitos B também estão envolvidos na geração de vesículas extracelulares (EVs). Essas pequenas vesículas liberadas pelos linfócitos podem transportar moléculas bioativas, incluindo proteínas e material genético, desempenhando papel crucial na comunicação intercelular. EVs podem modular a resposta imunológica, influenciando a ativação de outras células do sistema imunológico e desempenhando papel importante na regulação da inflamação. As EVs originadas de linfócitos B têm despertado crescente notoriedade na literatura devido ao seu potencial impacto em processos fisiológicos e patológicos
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    Acesso aberto (Open Access)
    Vesículas extracelulares derivadas de células estromais mesenquimais modulam células do sistema imune, induzindo um perfil regulador
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2019-01-29) Cunha, Flavia Franco Da [UNIFESP]; Camara, Niels Olsen Saraiva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8098379714093877; http://lattes.cnpq.br/6417937731855242; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introduction: Mesenchymal stromal cells (MSCs) can generate immunological tolerance due to their modulatory activity in T and B cells, dendritic cells (DCs) and natural killer cells. Extracellular vesicles (EVs) are one of the main mechanisms by which MSCs exert their actions. Objectives: In this study, our objective was to evaluate whether MSCs-EVs can, by themselves, modulate the immune response, generating a regulatory profile. Methods: MSCs were expanded and EVs were obtained by ultracentrifugation of the supernatant. Bone marrow-DCs were expanded with GM-CSF. The incorporation of MSCEVs by DCs and T cells was detected by confocal microscopy. Expression of surface markers was detected by flow cytometry (FACS) and cytokines were detected by RTPCR, ELISA, FACS and confocal microscopy. A miRNA PCR array was performed to evaluate the expression profile of miRNAs. Results: We demonstrated that MSC-EVs were incorporated by DCs and lymphocytes in vitro. Treatment with MSC-EVs did not affect the expression of surface markers on DCs, but affected their function, mainly by the increase of IL-10 protein. In addition, TCD4+ cells in the presence of DCs pretreated with MSC-EVs demonstrated less differentiation for a Th1 profile (IFNγ+) when compared to untreated DCs. When the effect of MSC-EVs was evaluated directly on T cells, addition of EVs induced less proliferation and less Th1 differentiation. Interestingly, in a specific Th1 polarization, the addition of MSC-EVs increased Foxp3 expression, also generating subpopulations of IFNγ+/Foxp3+ T cells. Previous treatment with RNAse appeared to partially abolish some of the functions, suggesting an important role of RNAs/miRNAs in this regulation. Finally, we observed a differential expression profile of miRNAs in Th1 cells treated with MSC-EVs, as well as modulation of one of their target genes, TGFbR2. The treatment with EVs also altered the mitochondrial metabolism of Th1-differentiated T cells, suggesting the involvement of the TGFβ pathway in this metabolic modulation. Conclusions: Our data suggest that MSCs-EVs are able to modulate the immune response, generating a regulatory profile, especially in activated T cells.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Vesículas extracelulares e sistema imunológico
    (Universidade Federal de São Paulo, 2020-10-02) Geraldo, Mariana Marques [UNIFESP]; Xander, Patricia [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3620553457348403; http://lattes.cnpq.br/9246970737548904
    Vesículas extracelulares são nanopartículas secretadas por quase todas as células presente em diferentes organismos (incluindo bactérias, fungos, protozoários, helmintos e células de mamíferos) e têm importante papel como mediadores na comunicação célula-célula e patógeno hospedeiro. As vesículas incluem os exossomos, microvesículas e corpos apoptóticos, diferenciadas pelo tamanho e composição e biogênese. Estudos mostraram a capacidade de vesículas extracelulares em armazenar e liberar moléculas como lipídios, proteínas e ácidos nucleicos e suas funções únicas relacionadas as células de origem como macrófagos e linfócitos. Trabalhos recentes mostraram que essas estruturas participam de diversos processos biológicos, da resposta imunológica, assim como no desenvolvimento de infecções e da progressão e patogênese de doenças infecciosas. Essas vesículas têm sido utilizadas para detecção, diagnostico e prognóstico de diversas doenças. A proposta deste trabalho foi realizar revisão bibliográfica sobre a estrutura das vesículas extracelulares, sua importância, sua ação no sistema imunológico e como podem ser utilizadas para diagnóstico de doenças negligenciadas, como a leishmaniose.