Navegando por Palavras-chave "Espectrometria de massas"

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    Análise da composição lipídica de corpos lipídicos isolados de fungos patogênicos e avaliação de seu papel biológico na resistência a antifúngicos azólicos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-11-30) Paula, Daisy Maria Bentes de [UNIFESP]; Toledo, Marcos Sergio de Toledo [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3308810633774571; http://lattes.cnpq.br/8944336887296917; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Lipids are critical molecules for proper cell function. Given its importance, specific lipid species are stored in organelles known as lipid droplets (LDs), which are intimately involved in lipid homeostasis. Recent studies have shown that lipid bodies present other important functions besides lipid reservoir and membranes biogenesis. These cell structures might also be involved in cell signaling, yrotection against lipotoxicity, inflammation, cancer, and pathogen-host interactions. Although there are several studies on mammalian cell LDs, the role of LDs in pathogenic fungi is not fully understood. In this study, we aim to characterize the lipid content of this organelle in pathogenic fungi and investigate the possible role of LDs in fungal resistance to azolic antifungal drugs. LDs were extracted from five different fungal species without using enzyme-disruption of the cell wall. The charaderization of lipid species was verified by column chromatography, HPTLC, and by electrospray mass spectrometry (ESI-MS and APCI-MS). Mass spectrometry of the chloroform fractions obtained by column chromatography revealed that the major lipids extracted from LDs isolated from Candida albicans, C. albicans 23R (resistant strain), C. dubliniensis, Aspergillus fumigatus and Para coccidioides bresitiensis were triacylglycerols (TAGs) and sterol-esters (SEs). In general by characterization of TAG, we were able to identify a total of 41 species of TAGs. TAG molecules that were more abundant in ali five species were 50:1, 50:2, 50:3, 52:1, 52:2, 52:3, 52:4, 54:1, 54:2, 54:3, 54:4, 54:5 and 54:6. DAG species were found in minor amounts, and the main compositions found were: 34:0, 34:1, 34:2, 36:0, 36:1, 36:2, 36:3, 36:4, 38:2,40:0, and compositions 34:1, 34:2, 36:2, 36:4 and 38:2 were the major species. Phospholipids (PLs) were also observed, probably from the LD monolayer. Corroborating the literature, the five fungal species exhibited a phospholipid profile that contained mostly phosphatidilcholines, followed by phosphatidilethanolamine and phosphatidilinositol. Sterol analysis revealed the ergosterol as the main sterol, excepted for C. albicans 23R and P. brasiliensis that presented mostly brassicasterol. SEs analysis revealed a wide range of possible combinations between sterols species and fatty acids, varying according to the fungal specie evaluated. For evaluation of biological role of LDs in azoles resistance, experiments cells treated with fluconazol showed the presence of oxide squalene in LD ~ctions in high levels when compared to the control group, especially in the resistant strain. These findings indicate that excess of specific lipid species triggered azolic antifungal drug treatment are sequestered and stored in lipid droplets. This also suggests that the non-resistant strain is less effective in the accumulation of ese lipotoxic compounds. We hypothesize that the resistant strain might have an over expression of genes related to LD biogenesis that increases the cell capacity of s orage of lipotoxic molecules in the LDs. This event might work as a resistance mechanism to azolic antifungal drugs, adding an important new biological role for LDs.
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    Análise do dimorfismo sexual em venenos da aranha acanthoscurria juruenicola por peptidômica quantitativa
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2018-06-28) Almeida, Erika Sayuri Nishiduka Costa De [UNIFESP]; Tashima, Alexandre Keiji [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3395922547042342; http://lattes.cnpq.br/9963736748632144; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Os aracnídeos estão entre os grupos de maior sucesso evolutivo da história do planeta, e um dos fatores de maior importância para isso é a produção de um veneno farmacologicamente complexo, composto por uma coleção de proteínas e peptídeos biologicamente ativos e altamente específicos. Apesar dos peptídeos constituírem grande parte da composição dos venenos, estudos peptidômicos ainda são escassos, consequentemente as identidades e atividades biológicas de muitos desses peptídeos permanecem desconhecidas. Além disso, em diversas espécies de aranhas é observado dimorfismo sexual, o que pode ocasionar diferenças nas composições de venenos de machos e fêmeas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar e comparar quantitativamente o perfil peptídico do veneno de espécimes machos e fêmeas da aranha Acanthoscurria juruenicola. Peptídeos nativos foram fracionados por extração em fase sólida e analisados por espectrometria de massas, assim como seus fragmentos gerados pela digestão isolada por 5 enzimas distintas (tripsina, quimotripsina, termolisina, GluC e Aspn). Os dados espectrais foram submetidos a análise de novo, busca em banco de dados de transcriptoma de glândula e sobreposição das clivagens utilizando ferramentas de bioinformática. Dentre 11 sequências maduras de toxinas completamente mapeadas, 8 eram novos peptídeos ricos em cisteínas, apresentando entre 3 a 5 ligações dissulfeto. Buscas em bancos de sequências de A. geniculata e Araneae resultaram em mais 24 proteínas homólogas identificadas. Observamos dimorfismo sexual no veneno: a concentração total de toxinas nos venenos das fêmeas foi aproximadamente 5 vezes superior à dos machos e apresentaram peptídeos com significativa expressão diferencial. Uma das toxinas de maior expressão em fêmeas, a U2TRTXAj1b, de massa molecular 4,9 kDa e 3 ligações dissulfeto, foi fracionada por cromatografia de filtração em gel. Essa toxina apresentou atividade citotóxica contra aproximadamente 44% das células de melanoma da linhagem A375 em ensaios de MTT em concentração de 3,8 μM. Esses resultados podem evidenciar diferenças em toxicidade e comportamento biológico de acordo com o gênero do animal, além de embasar a potencial aplicação biotecnológica desses peptídeos na área farmacológica.
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    Análise do perfil metabolômico do líquido folicular de pacientes com síndrome dos ovários policísticos submetidas ao tratamento de fertilização in vitro
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-03-28) Cordeiro, Fernanda Bertuccez [UNIFESP]; Lo Turco, Edson Guimaraes [UNIFESP]; Andrade, Sheila Siqueira; http://lattes.cnpq.br/0735499055744493; http://lattes.cnpq.br/0251394799200508; http://lattes.cnpq.br/3076848974586113; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Objectives: Analyze the metabolomic profile of follicular fluid from patients with and without hyper response to controlled ovarian stimulation, associated or not with polycystic ovary syndrome (PCOS). Method: Follicular fluid samples from 81 patients were obtained from patients undergoing in vitro fertilization, considering three groups: control group (n = 22); hyper responders (HR, n = 44) and PCOS (n = 15). The samples were prepared according to the respective metabolomic approaches, which included liquid-chromatography mass spectrometry (LC-MS) and Paper Spray ionization mass spectrometry (PS-MS). Results: Clinical data showed that the groups differ based on age, FSH, FSH/LH rate, number of punctured follicles, oocyte recovery rate, number of oocytes, oocytes in metaphase II and I, inseminated and fertilized oocytes, number of embryos at days 2 and 3 of cultive and on the embryo quality. The LC-MS analysis showed 14 metabolites of higher abundance, which were attributed as fatty acids, diacylglycerol, triacylglycerol, ceramide, phosphatidylcholine and sphingomyelin. The PCOS group presented one compound of higher abundance that was not attributed. The PS-MS demonstrated 9 metabolites more abundant for the control group that were attributed to fatty acids, monoacylglycerol, lyso-phosphoglycerol, lyso-sphingomyelin and sphingosine-1-phosphate. Four metabolites were of higher abundance for the PCOS group, for which the attribution was not possible. The HR group showed high abundance of 2 metabolites and one was attributed as Lyso-phosphoinositol-phosphate. Conclusion: The follicular fluid metabolomic analysis for patients with PCOS and hyper response to gonadotropins demonstrated differences among the groups that could be associated with oocyte quality and consequent embryo quality and development. In addition, the attribution of metabolites indicated that the study of these compounds may assist on elucidation of pathophysiological mechanism related to PCOS and the risk of hyper response to controlled ovarian stimulation.
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    Análise metabolômica no plasma seminal de pacientes com varicocele
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-03-15) Araújo, Sophia Costa [UNIFESP]; Bertolla, Ricardo Pimenta [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8479803539567479; http://lattes.cnpq.br/1258540605837356
    Introdução: A varicocele é uma condição médica caracterizada pela dilatação anormal das veias do plexo pampiniforme. Em alguns casos, a varicocele pode afetar a fertilidade, uma vez que o aumento das veias pode elevar a temperatura local, prejudicando a produção e qualidade dos espermatozoides. A metabolômica se define como a identificação, quantificação e análise de um conjunto amplo de metabólitos para entender como os processos metabólicos estão funcionando em um sistema biológico específico. Essa técnica pode auxiliar na investigação dos processos bioquímicos associados à fertilidade masculina, além de doenças como a varicocele. Objetivo: Avaliar o perfil metabolômico de pacientes diagnosticados com varicocele, comparando-os com pacientes sem varicocele e apresentando normozoospermia. Metodologia: Trata-se de um estudo de coorte que realizou a análise metabolômica por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) em amostras de pacientes divididos, inicialmente, em dois grupos: (i) controle; (ii) com varicocele. Posteriormente, o grupo de varicocele foi dividido em: (iii) com varicocele e normozospérmicos; (iv) com varicocele e sêmen alterado. Resultados: Considerando a comparação entre os três grupos de análise, foi observada diferença significativa nos metabólitos ureia (N_urea), serina (N_serine), ácido aspártico (N_aspartic acid), treitol (N_threitol), manitol (N_mannitol/sorbitol) e maltose (N_maltose/cellobiose) entre os grupos. Comparando apenas os dois grupos, foi observada diferença significativa nos seguintes metabólitos: fenilacetaldeído (N_phenylacetaldehyde), ureia (N_urea), serina (N_serine), treitol (N_threitol), ácido piroglutâmico (N_pyroglutamic acid), ribose (N_ribose) e N-acetilmanosamina (N_N-acetyl-D-mannosamine). Conclusão: Foram observadas diferenças significativas entre os grupos de análise.
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    Análise proteônica comparativa dos efeitos neurotóxicos dos agentes quimioterápicos cisplatina e carboplatina sobre célula epitelial do tubulo proximal humano(HK-2)
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2009) Perez, Juliana Dinéia [UNIFESP]; Casarini, Dulce Elena [UNIFESP]
    Quimioterápicos, como a cisplatina (CPT, cis-diaminodicloroplatina II) e seu análogo carboplatina (CB, diamina - 1,1 – ciclobutanodicarboxilato - platina II), são cada vez mais utilizados como drogas antitumorais, altamente eficazes no tratamento de diversos tipos de neoplasias. Estudos demonstram que células do túbulo proximal renal representam o primeiro alvo para diversas nefrotoxinas, tais como os quimioterápicos. Sendo assim, utilizamos como modelo de estudo a cultura de célula imortalizada epitelial do túbulo proximal renal de humanos (HK-2). Nosso objetivo foi identificar por meio de análise por eletroforese bidimensional e técnicas proteômicas, proteínas das células HK-2 que podem apresentar-se sub ou superexpressas quando estas células são submetidas aos tratamentos com CPT e CB e que, por consequência desta alteração, estejam envolvidas no processo de nefrotoxicidade. As células HK-2 foram divididas em três grupos: Controle (n=8), tratadas com CPT (n=8) e com CB (n=8), separadamente. Utilizamos tratamentos com 100 µM de CPT e 50 µM de CB. Após técnica de eletroforese bidimensional (2-DE), densitometria e análise dos géis de cada grupo de estudo e análise no programa PdQuest (Bio-Rad, EUA), quantitativa e qualitativamente, detectamos um total de 373 spots: 124 spots para CT, 122 para CPT e 127 para CB. Desse total, 81 spots tiveram sua concentração protéica alterada. Por análise qualitativa, a proteína da subunidade alfa da síntese de ATP (ATPA) e a serinohidroximetiltransferase (GLYM) apareceram apenas nos géis do grupo CPT. Já o fator alfa de elongação (EF1A1) apareceu somente no grupo CT, desaparecendo quando as células foram tratadas com CPT e CB. Quando da análise das proteínas que sofreram alterações quantitativas, verificamos que duas proteínas, a tioredoxina dependente de peróxido (PRDX3) e a alfa-enolase (ENOA) desapareceram nos géis do grupo CPT, sendo expressos somente nos géis dos grupos CT e CB. Heat shock protein 70 kDa (Hsp70) não apareceu nos géis do grupo CT, sendo detectada apenas nos grupos CPT e CB. Duas proteínas foram detectadas nos três grupos de estudo, a heat shock protein 60 kDa (Hsp60) e a proteína homóloga headcase (HDC). A detecção das proteínas do epitélio do túbulo proximal renal que estão alteradas quando submetidos ao tratamento com CPT e CB, poderá gerar ferramentas importantes para o desenvolvimento de novos medicamentos, que poderia reduzir complicações renais decorrente dessa nefrotoxicidade em pacientes com câncer que fazem tratamento com quimioterápicos..
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    Análises metabolômica e de peroxidação lipídica do líquido folicular de pacientes submetidas ao tratamento de fertilização in vitro somente com FSH e com adição de LH
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2018-05-29) Costa, Livia Do Vale Teixeira da [UNIFESP]; Fraietta, Renato [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Objective: To assess the effect of exogenous LH addition during ovarian stimulation in the metabolomic profile and lipid peroxidation levels in the follicular fluid of women undergoing IVF. Methods: A retrospective selfparing study was performed in which 36 patients were submitted to assisted reproduction treatments under different ovarian stimulation protocols. The patients were divided into two groups: FSH group, composed of 3 6 follicular fluid samples of patients that received FSH only as gonadotropin in the first treatment; and LH group, composed of 36 samples of the same patients who returned to the assisted reproduction section and received a new stimulus, in which LH was added to treatment. Results: The analysis of the clinical data showed no statistical difference in the clinical parameters of the patients when LH was added. The metabolomic analysis showed that there was a different pattern of metabolites among the same patients submitted to different stimuli, determined by the presence of 5 categories of lipids: fatty acids, sphingolipids, glycerophospholipids, prenols and sterols. Analysis of lipid peroxidation showed that there was no statistical difference between the groups. Conclusion: From the results obtained, we could observe that there is a change in the pattern of metabolites when the exogenous LH is added to the ovarian stimulus. This finding may help in determining the most efficient protocol for each patient and, later, in the determination of therapeutic targets for personalized treatments.
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    Caracterização bioquímica das vesículas extracelulares isoladas das cepas Y e Yuyu do Trypanosoma Cruzi
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-03-09) Ribeiro, Kleber Silva [UNIFESP]; Torrecilhas, Ana Claudia Trocoli [UNIFESP]; Iwai, Leo Kei [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/9890151030133485; Lattes http://lattes.cnpq.br/7344293560367809; http://lattes.cnpq.br/5448560665978232; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Abstract The Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, releases EVs containing a wide range of surface glycoconjugates of the parasite. Extracellular vesicles (EVs) are particles released by different cell types and pathogens, under physiological and pathological conditions, containing proteins, lipids and nucleic acids. In the present work, we purified, isolated and compared EVs from Y strain (DTU Tc II) and YuYu strain (DTU Tc I) of T.cruzi, that belonging to different discrete typing units (DTU) and having a different degree of virulence. Initially, scanning electron microscopy (SEM) was performed to visualize the trypomastigote form of T.cruzi releasing the EVs from the plasma membrane and visually the trypomastigotes of the YuYu strain released more particles. The characterization of EVs about size and concentration was done using the nanoparticle tracking analysis (NTA) technology. Don't had significant difference when compared the mean size (150nm) of the EVs, but the concentration of particles in the YuYu strain sample was higher than in the Y strain sample, confirming the SEM analysis. Qualitative analysis by immunoblotting showed that EVs from both strains express transialidase (TS) and cruzipain, but the expression is higher in EVs from YuYu strain. By LC-MS/MS, the major glycoconjugates belonging to T. cruzi multigenic families, such as TS, Mucins, mucin-associated surface proteins (MASP), GP63 surface proteins, among others, were detected in EVs of both strains, but it was possible to identify more different proteins in EVs from YuYu strain than in EVs from Y strain. Phospholipid (PL) analysis by Thin Layer Chromatography (TLC), GC-MS and MALDI-TOF suggests the presence in EVs of PL such as phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylserine (PS). The YuYu strain, which is more virulent, releases more EVs containing more proteins and expressing more of the glycoconjugates in common with EVs from Y strain. This difference may be important in parasite infectivity, since the EVs have a function of intercellular communication at distance and direct contact and may be involved in different mechanisms during parasite-host interaction such as cellular invasion, immunomodulation and evasion of the host immune system.
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    Caracterização da diversidade molecular de venenos das serpentes brasileiras Bothrops cotiara e Crotalus durissus terrificus
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-10-25) Miyamoto, Jackson Gabriel [UNIFESP]; Tashima, Alexandre Keiji [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/3395922547042342; https://lattes.cnpq.br/6810692982835469
    A variabilidade composicional das peçonhas de serpentes retrata a evolução toxinológica e a adaptação a diferentes nichos ecológicos. Essa variabilidade tem sido observada em relação a diferentes fatores, como idade, dieta, gênero, sazonalidade, e distribuição geográfica. As grandes famílias de toxinas reproduzem a diversificação por meio de adaptação evolutiva, neo-funcionalização e retenção de múltiplos genes parálogos, manifestando-se como variações quantitativas e qualitativas. Em oposição a alterações arbitrárias, a diversificação composicional aparenta ser inerente às estruturas biológicas. No intuito de se investigar a variabilidade e diversidade da peçonha de duas serpentes brasileiras, o repertório de toxinas foi avaliado através das abordagens peptidômica e proteômica. No Capítulo 1, diversos novos peptídeos foram caracterizados por análise peptidômica no veneno da serpente Bothrops cotiara. Dentre os peptídeos identificados, um novo fragmento críptico de uma metaloproteinase apresentou inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA), com constantes de inibição abaixo de 1 µM. Este inibidor não canônico da ECA não atende ao consenso estrutural de peptídeos potenciadores de bradicinina de serpentes, e apresenta semelhanças estruturais com a bradicinina e peptídeos relacionados à bradicinina. Desta forma, os resultados contribuem para o repertório de peptídeos biologicamente ativos derivados de venenos de serpentes capazes de inibir a ECA para além das estruturas e precursores conhecidos. No Capítulo 2 foi realizada uma análise abrangente da peçonha de Crotalus durissus terrificus, revelando mutações e dimorfismo sexual em níveis peptidômico e proteômico. A análise de mutações revelou novas toxinas com alinhamento estrutural predito condizente com estruturas homólogas/parálogas determinadas experimentalmente. Uma vez que as variações de resíduos não ocorreram em aminoácidos centrais de interação das toxinas, os resultados sugerem que as mutações observadas podem não impactar significativamente a estabilidade e funções dessas proteínas, sugerindo a conservação estrutural de toxinas evolutivamente relacionadas. O conhecimento acerca da diversidade toxinológica pode contribuir com o avanço no tratamento adequado de acidentes ofídicos, e consequentemente, para o combate dessa doença tropical negligenciada, bem como pode fundamentar o desenvolvimento de novos fármacos através da prospecção destas vastas bibliotecas de toxinas.
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    Determinação do perfil lipidômico de soro humano para rastreamentode potenciais biomarcadores de carcinoma hepatocelular associado às hepatites virais
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-08-27) Passos-Castilho, Ana Maria [UNIFESP]; Granato, Celso Francisco Hernandes [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7880516839350591; http://lattes.cnpq.br/0777557108092703; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introdução: A lipidômica é a ciência que visa identificar e quantificar o perfil global ou parcial de lipídios presentes em um sistema biológico em um determinado tempo. O carcinoma hepatocelular é o sexto câncer mais comum em todo o mundo e as hepatites crônicas B e C representam a sua principal causa. Biomarcadores para o diagnóstico do carcinoma hepatocelular ainda são escassos. Objetivos: Avaliar a aplicabilidade da lipidômica como ferramenta para rastreamento de biomarcadores de carcinoma hepatocelular, desenvolver e padronizar um método de lipidômica eficaz para detecção global e quantificação relativa de lipídios em amostras de sangue periférico humano, e determinar o perfil lipidômico de soro humano no carcinoma hepatocelular associado às hepatites virais B e C para rastrear biomarcadores com potencial diagnóstico. Métodos: Primeiramente realizou-se um estudo piloto em que o perfil lipidômico de 25 pacientes com carcinoma hepatocelular associado à hepatite C obtido por espectrometria de massas por dessorção/ionização a laser assistida por matriz foi comparado ao de 15 pacientes com cirrose hepática e 25 pacientes com hepatite crônica. Em seguida, desenvolveu-se e padronizou-se um método de lipidômica utilizando cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas por ionização por spray de elétrons. A seguir, realizou-se um estudo de aplicação do método padronizado com pacientes com hepatite B crônica em que foram incluídos 32 pacientes com carcinoma hepatocelular, 30 com cirrose hepática, 25 com hepatite B crônica e 34 controles saudáveis. Por fim, realizou-se um estudo de aplicação do método padronizado em pacientes com hepatite C crônica, com 56 pacientes com carcinoma hepatocelular, 59 com cirrose hepática, 62 com hepatite C xx crônica e 58 controles saudáveis. Candidatos a potenciais biomarcadores foram selecionados por análise estatística e curvas de característica de operação do receptor foram geradas para comparar a acurácia dos biomarcadores selecionados e níveis de alfafetoproteína no diagnóstico do carcinoma hepatocelular. As bases The Human Metabolome Database e The LIPID MAPS Lipidomics Gateway foram pesquisadas para a identificação dos candidatos por meio de sua relação massa/carga. Resultados: O estudo-piloto inicial resultou em um algoritmo de 7 picos que foi capaz de distinguir carcinoma hepatocelular de cirrose hepática com sensibilidade de 96% e especificidade de 87%. Em seguida, o método desenvolvido de cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas por ionização por spray de elétrons apresentou boa performance na separação de diferentes grupos estudados e na detecção de diferentes espécies de lipídios de várias ordens de grandeza. A seguir, o perfil lipidômico distinguiu os pacientes com câncer e forneceu um diagnóstico mais preciso para os pacientes com cirrose hepática que a detecção convencional de alfafetoproteína. Foi possível distinguir carcinoma hepatocelular associado à hepatite B com sensibilidade de 78% e especificidade de 64%. Por fim, pôde-se distinguir carcinoma hepatocelular associado à hepatite C de cirrose hepática com 100% de sensibilidade e especificidade utilizando 13 candidatos, incluindo a PC(32:1). Conclusões: O presente estudo confirmou a possibilidade de aplicação de um método lipidômico por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas para a distinção entre carcinoma hepatocelular e cirrose hepática e identificou a PC(32:1) como um potencial novo biomarcador eficaz para a detecção precoce do carcinoma hepatocelular associado à hepatite C crônica.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo bioanalítico e proteômico de sarcoma de Hippopotumus amphibius
    (Universidade Federal de São Paulo, 2014-10-24) Silva, Adriana Rodrigues [UNIFESP]; Assunção, Nilson Antonio de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    This project aims to analyse the protein profile of a Hippopotamus amphibius' sarcoma. Using proteomic analysis on three tissue samples of an animal that passed away due to the advanced stage of the disease, an origin tumor, a heart metastasis and an healthy tissue. Initially, the protein separation was programmed to be performed using bi-dimensional electrophoresis. The small quantity of tissue sample also forced us to use a second methodology, without previous protein separation processes. After the protein samples were handled, they were submitted to the trypsin enzymatic action, followed by purification. The next stage involved the sample analysis using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, and data analysis using the Mascot software. The small quantity of tissue samples available made the use of a second methodology necessary, in order to obtain complementary data. Samples from the primary tumor, the heart metastasis, and healthy tissue were submitted to the shot gun, without previous separation of the proteins, going through enzymatic digestion, and the resulting peptides processed with chromatographic separation coupled with mass spectrometry, using the same identification strategy in the first methodology. Though the bi-dimensional gel separation is an expensive and time-costly methodology, it proved to be the more adequate to identify proteins involved in specific biological processes, such as the ones involved in diseases like cancer. The first methodology, that used a protein bi-dimensional gel separation, identified 33 proteins involved in the growth and development of tumors, and the second methodology, that have not used prior separation of the proteins, identified only 8 proteins that are possibly involved in the same cancer related processes. Both methodologies had great value on the development of this study, enabling the work with two strands of proteomics, aiding in the proposed objective, each offering a specific characteristic. The first one was more adequate to the identification of the proteins involved in specific biological processes. The second one, in the ample identification of the proteins expressed in the analyzed tissue. The results can be applied in future studies, that can verify the relation of these proteins with the development and functioning of tumors and the constant improvement of animal conservancy, offering a better understanding of the diseases that affected both animals and humans.
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    Embargo
    Estudo bioanalítico-metabolômico: explorando o metabolismo da deficiência do hormônio do crescimento na busca por assinaturas bioquímicas
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-04-27) De San-Martin, Breno Sena [UNIFESP]; Assunção, Nilson Antônio de [UNIFESP]; Carvalho, Luciani Renata Silveira; Ferreira, Vinícius Guimarães; http://lattes.cnpq.br/9376176929300767; http://lattes.cnpq.br/7563987453189793; http://lattes.cnpq.br/4183619506352119; http://lattes.cnpq.br/9486020248465637
    Introdução: A inaptidão da hipófise em produzir e liberar o GH (Growth Hormone) é uma condição clínica rara que afeta o crescimento pós-natal e funções biológicas durante toda a vida, incluindo o metabolismo intermediário, metabolismo lipídico e homeostase. A falta de biomarcadores robustos para o diagnóstico da deficiência de GH permanece um desafio, juntamente com a necessidade de monitoramento da terapia de reposição do hormônio do crescimento. Entre as ciências ômicas, a metabolômica utiliza ferramentas analíticas na identificação e/ou quantificação, em larga escala, de metabólitos. Perfis metabolômicos permitem compreender o estado fenotípico, logo, a metabolômica torna-se uma aliada na busca por novos biomarcadores e a compreensão de processos biológicos da GHD. Métodos: Para o estudo transversal, utilizou-se plasma de pacientes adultos diagnosticados com GHD congênita (N=71), sendo os em reposição (GHDon N=29) e sem reposição (GHDoff N=42), e o grupo controle saudável (n=41). Abordagem metabolômica e lipidômica foram realizadas por infusão direta em espectrometria de massas. O fluxo de pré-processamento e tratamento de dados foram empregados na seleção de features para análise de dados. O modelo estatístico PLS-DA foi usado na obtenção de variáveis correspondente nas análises exploratórias comparativas, logo, validação-cruzada, teste de permutação e curva ROC foram utilizados para avaliação de desempenho preditivo. Também se fez uso de análises exploratórias multivariadas baseadas em curva ROC a partir de features significativos. Anotação putativa de metabólitos e lipídios foi por meio de banco de dados metabolômicos aplicando filtros de erro (até 5 Δ ppm) e formação de adultos. Substancial parte de pré-processamento e intepretação de dados foram realizadas na plataforma metaboanalyst versão 5.0 Resultados: As análises de vias bioquímicas mostraram alterações no metabolismo de classes relacionadas a composição corporal, enquanto a lipidômica corroborou a alteração nos glicerofosfolipídios e ácidos graxos na população adulta com ou sem reposição de GH. Enquanto na metabolômica foi possível identificar alterações no metabolismo de aminoácidos proteinogênicos/glicogênicos. Os subgrupos GHDon e GHDoff apresentaram alterações semelhantes quando comparados ao controle, ou seja, apresentaram padrões de alterações bioquímicas que são fontes para novos candidatos a biomarcadores da deficiência de GH e/ou acompanhamento de terapia de reposição hormonal.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo de assinaturas metabólicas em leiomiomas uterinos
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-07-12) Barison, Gustavo Anderman Silva [UNIFESP]; Gomes, Mariano Tamura Vieira [UNIFESP]; Bonduki, Claudio [UNIFESP]; Castro, Rodrigo de Aquino [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6590913930590292; http://lattes.cnpq.br/7384818983129643; http://lattes.cnpq.br/6319329004052486; http://lattes.cnpq.br/7168607477194335
    Objective: The present study evaluated circulating metabolites in the plasma of patients with and without leiomyomas, to define a metabolomic profile of these patients and compare them according to leiomyomas' presence and uterine size. Methods: Cross-sectional observational study, including women divided into three groups: 37 with leiomyomas and uterus over 500 cm3, 17 with leiomyomas and uterus up to 150 cm3, and 21 leiomyoma-free women. Patients underwent peripheral blood collection that was further evaluated using untargeted metabolic assessment by gas chromatography coupled to mass spectrometer. Results: There was no statistical difference between patients’ anthropometric and demographic features and general laboratory tests. Groups were statistically different for uterus volume (p<0.0001). Forty six metabolites were identified in all samples (35% were amino acids and derivatives, 22% were fatty acids and 18% were carbohydrates). Statistically significant metabolic distinction (p<0.05 and FDR<0.05) was observed for 14 metabolites. Amino acids, except for L-glutamine, were significantly reduced in plasma levels of patients with large leiomyomas. Fatty acids and carbohydrates were progressively reduced in patients with leiomyomas and even more reduced in plasma levels of patients with large leiomyomas, except for an increase in alpha- linolenic acid. Conclusion: There are differences in plasma metabolites levels of amino acids, fatty acids, and carbohydrates among patients with leiomyomas and large leiomyomas compared to leiomyoma-free patients. These metabolites are especially reduced in patients presenting large leiomyomas. This metabolic panel is an initial step for the definition of possible biomarkers and metabolic signatures of the uterine fibroid. Keywords: Leiomyoma, Metabolomics, Mass spectrometry, Lipidomics, Gas chromatography, Omic.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo do perfil proteômico do tamanduá-mirim (T. tetradactyla)
    (Universidade Federal de São Paulo, 2014-12-17) Coelho, Mariana de Moraes [UNIFESP]; Assunção, Nilson Antonio de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The increase in anthropological impacts led to the decrease of places that were the natural habitat of several species of animals. This occurrence brought a disadvantage to animal life and the conservation of these species. The understanding of diseases that affect these animals urges as the proximity to the man, as well as the understanding of their behavior, their biological description and biochemical changes. This study aims to identify the proteomic profile of collared anteater (T. tetradactyla) captive in Zoological Foundation Park of São Paulo, identifying potential biomarkers of health conditions of these animals and to better understand the lives of these captive. This study, wich addressed an unprecedented way an understanding of the species through mass spectrometry, identified proteins, being the main protein complement C3, fibronectin, fibrinogen (Alpha chain, beta chain and gamma chain), vitronectin, the protein complement C4 and ceruloplasmin protein, protein these obesity-related (wich affects most samples, based on their body mass), diabetes (previously diagnosed in an animal), cardiac events and some types of cancers, some of these characteristics typical of captive animals and previously detected in other studies about the species, which alerts the real need for adjustments and medical care of these animals.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo dos produtos de oxidação do eugenol com ozônio
    (Universidade Federal de São Paulo, 2021-07-05) Pereira Junior, Marcos Accioly [UNIFESP]; Uemi, Miriam [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4685835574154025; http://lattes.cnpq.br/7022270128734007
    Eugenol é um metabólito secundário encontrado em diversas plantas como cravo, canela e manjericão, atuando no mecanismo de defesa contra fungos, bactérias e espécies reativas de oxigênio (ERO). Uma destas ERO é o ozônio (O3), gás formado na troposfera a partir de reações fotocatalíticas entre hidrocarbonetos, óxidos nítricos (NOx) e dióxido de carbono (CO2). Estudos evidenciam o efeito do ozônio em plantações agrícolas, gerando danos e grandes perdas econômicas. Nosso estudo apresenta resultados da reação do eugenol em diferentes solventes, quando expostas a atmosfera de O3. Os produtos da reação foram purificados e analisados por técnicas espectroscópicas de ressonância magnética nuclear (RMN), infravermelho (IV) e massa (EM), que permitiu a identificação dos seguintes compostos: a homovanilina, 4-((1,2,4-trioxolan-3-il)metil)-2-metoxifenol, 4-(2-etoxietil-2-hidroperóxi)-2-metoxifenol, 4-(2-etoxietil-2-hidroperóxi)-2-metoxifenol e 4-(2-hidroperóxi-2-isopropoxietil)-2-metoxifenol, sendo estes três alcóxi-hidroperóxidos ainda não descritos em literatura. O mecanismo de formação destes compostos é baseado no mecanismo de Criegee, que envolve a cicloadição [2+3] do O3 à olefina do eugenol, formando um ozonídeo primário, seguido de quebras de uma ligação C-C e uma ligação O-O, gerando um óxido carbonílico e formaldeído. A estabilização do óxido carbonílico formado pode ocorrer por redução e rearranjo gerando a homovanilina, ou por adição nucleofílica acílica, formando os alcóxi-hidroperóxidos. Estes alcóxi-hidroperóxidos podem ter atividade biológica devido à presença de grupos funcionais como hidroperóxido e fenol, objeto do próximo estudo.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudos bioanalíticos aplicados à busca do perfil de metabólitos em portadores da síndrome Cri Du Chat
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-07-31) Furtado, Danielle Zildeana Sousa [UNIFESP]; Assunção, Nilson Antonio de [UNIFESP]; Silva, Heron Dominguez Torres da [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/2253809699898165; http://lattes.cnpq.br/4183619506352119; http://lattes.cnpq.br/3063045899234754; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introdução: A síndrome de Cri Du Chat é uma doença rara, caracterizada por choro semelhante ao miado de gato, resultante de uma deleção na região do braço curto do cromossomo 5. Objetivo: Efetuar a caracterização do perfil dos metabólitos em pacientes portadores da Síndrome Cri-Du-Chat comparando a indivíduos com metabolismo normal de uma mesma família, através da análise metabolômica e abordagem Quimiométrica. Metodologia: As amostras do plasma sanguíneo e da urina foram coletadas de pessoas de ambos os sexos com idade (1 a 38 anos), coletado no total de 38 amostras de plasma e urina, posteriormente, analisadas por ultra cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas, eletroforese capilar, cromatografia de íons, conseguinte foi aplicado o teste estatístico de Wilcoxon e uma abordagem quimiométrica para as interpretações dos resultados do ponto de vista bioquímico. Resultados: Houve um aumento plasmático dos níveis da metionina-sufóxido, aspartato e serotonina; e diminuição dos níveis da citosina, histidina, isoleucina, leucina, ornitina, fenilalanina, valina, creatinina, também foi avaliado o aumento da atividade do superóxido dismutase e diminuição dos tíos císteina e glutationa. Na urina foram observados o aumento das concentrações dos seguintes metabólitos: alanina, asparagina, aspartato, citrulina, glutamina, histidina, fenilalanina, serina, treonina, tirosina, triptofano, metionina sufóxido e sarcosina. Conclusões: Os portadores da desordem genética apresentaram alterações metabolômicas, que podem estar relacionados em processos de estresse oxidativo, alterações pirimídicas, ciclo da uréia, ciclo do ácido cítrico e alterações na biossíntese de aminoácidos, via serotonérgica e modificações no processo do catabolimos e anabolismo.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudos de bioequivalência de brometo de n-butilescopolamina em forma de comprimidos e de seus metabólicos em plasma humano de voluntarios sadios
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2016-03-31) Suenaga, Eunice Mayumi [UNIFESP]; Nakaie, Clovis Ryuichi [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1133653893267841; http://lattes.cnpq.br/9663004167769394; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The N-butylscopolamine bromide though a drug widely widespread and used as an antispasmodic, both in the population as in Worldwide, there are very few scientific papers published about him, especially in relation to its pharmacokinetics: absorption, metabolism and excretion. With the advance of techniques of separation and quantitation of chemical substances present in biological fluids and tissues, as well as the development of equipment with high sensitivity, capable of detecting traces, today we trace farrnacocinético profile of parent drug and metabolites, even those drugs considered action site with low absorption such as N-butyl scopolamine. In this work we developed three methods of extraction and detection by LCMS / MS capable of identifying N-butylscopolamine in human plasma after ingestion a single 10mg tablet of Buscopan, the first two with purpose of quantifying the N-butylscopolamine to determine Bioequivalence between formulations Furp (Test) and Buscopan (Reference) and third to identify potential metabolites of N-butyl scopolamine .in plasma human .. The first two methodologies were developed and validated and considered suitable for quantification of N-butylscopolamine in human plasma, the first by online solid-liquid extraction (online SPE) and high performance liquid chromatography efficiency coupled with mass spectrometry (LC-MSIMS) with a range of concentration:. 0.05 to 40 ng / ml, range withdrawn from the literature. The second methodology Liquid-liquid extraction and chromatography coupled with ultra efficiency mass espectrôrnetro (FPLC-LLE-MS / MS), with a concentration range of 1 to 1000 pg / ml, which allowed quantify and trace the pharmacokinetic profile of Nbutilescopolamina for the determination of bioequivalence between the two formulations butylscopolamine bromide, following ingestion of a single 10 mg tablet. Using 58 volunteers, due to high intra-individual variability, proven by statistical calculations (38%), the two formulations: tablet Coated 10mg butylscopolamine bromide FURP Buscopan and '' were 25
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    Exploração da quimiodiversidade de Urena lobata e Myrsine guianensis através de estratégias analíticas modernas para a descoberta de metabólitos bioativos
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-04) Machado, Fernando Cassas Salles; Veiga, Thiago André Moura [UNIFESP]; Medeiros, Livia Soman [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7404733691134037; http://lattes.cnpq.br/8190975614526360; http://lattes.cnpq.br/4198946458633556
    O relacionamento de diferentes agrupamentos humanos com espécies vegetais tem origem desde o desenvolvimento das primeiras culturas. Por meio de seus maquinários enzimáticos, as plantas conseguem biossintetizar uma quantidade inestimável de substâncias, sendo que a Química de Produtos Naturais acessa tal quimiodiversidade por meio de ferramentas analíticas. Diante dessas perspectivas, neste trabalho foi realizado o estudo das espécies Urena lobata e Myrsine guianensis empregando abordagens integradas, para a busca de metabólitos bioativos em três alvos: leucemia humana, carcinomas (colorretal e mama) e a busca por ligantes para acetilcolinesterase (AChE). A partir da análise metabolômica (CLEM) da fração em diclorometano de U. lobata (ULD) foi possível anotar 18 metabólitos (u1u18). Adicionalmente, o desenvolvimento de métodos de purificação por HPLC permitiu o isolamento e caracterização estrutural de cinco compostos (u8, u19, u20, u21 e u22). As mesmas estratégias foram conduzidas para o estudo de M. guianensis, onde a partir do extrato em acetato de etila das folhas (MGA) da espécie foi possível realizar a anotação 17 compostos (m1m17), além do isolamento de cinco substâncias (m1, m2, m3, m5 e m6), sendo que dois destes são inéditos na literatura: os ácidos myrsinoicos G e H. Na busca por metabólitos citotóxicos, a fração ULD apresentou EC50 = 36 μg/mL frente a linhagem de leucemia Raji após 24 h de tratamento. Para as linhagens Kasumi1 e Jurkat, as subfrações ULD1 a 7, bem como os extratos de M. guianensis inibiram em até 60 % a proliferação celular após 48 h. Os compostos u8, u19, u20, u22, m1 e m2 foram testados frente às linhagens Kasumi1, Jurkart, K562 e KG1, mas não apresentaram efeito citotóxico após 24 h de experimento. Os compostos u8, u19, u20, u21, u22, m1, m5 e m6 tiveram a sua viabilidade celular testada frente às linhagens de carcinoma HTT116 e MCF7 por 72 h, onde m6 apresentou EC50 = 57,87 μM. Como resultado dos ensaios para a identificação de ligantes para AChE os compostos m1 e m8 foram identificados como ligantes por apresentar razão de afinidade igual a 4.59 e 81.49, respectivamente.
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    Acesso aberto (Open Access)
    ICP-MS Espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado
    (Quipá, 2023) Nogueira, Angerson [UNIFESP]; Brito, Andréa Santana de [UNIFESP]; Coelho, Alana da Conceição Brito [UNIFESP]; Vieira, Amanda Basilio; Cavalcante, Cleusa [UNIFESP]; Labuto, Geórgia [UNIFESP]; Santos, Lúcia Fernanda dos [UNIFESP]; Barros, Matheus de Lima Ribeiro [UNIFESP]; Lourenço, Riad Dantas [UNIFESP]; Lorençatto, Rodolfo; http://lattes.cnpq.br/6172517093430235; http://lattes.cnpq.br/4316852369792661; http://lattes.cnpq.br/3800019382911869; http://lattes.cnpq.br/8783761969208327; http://lattes.cnpq.br/2683570921094361; http://lattes.cnpq.br/4933252636705546; http://lattes.cnpq.br/1936782194249535; http://lattes.cnpq.br/5088524209332456; http://lattes.cnpq.br/1827737135835318; http://lattes.cnpq.br/9249201526927080
    O propósito desta obra foi proporcionar um texto simples e objetivo para introduzir a técnica de espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) para alunos de graduação. A intenção foi criar um material objetivo e acessível, que possa servir como introdução ao tema. Para isso, contamos com a participação de alunos de graduação e pós-graduação na redação e elaboração desta obra, com o objetivo de tornar a linguagem mais próxima ao público-alvo. A técnica de ICP – MS tem sido utilizada em diversas áreas, como a química, biologia e geologia, por exemplo. Ela permite a identificação e quantificação de elementos químicos presentes em amostras. No entanto, essa técnica pode parecer complexa para iniciantes, com muitos termos e conceitos específicos. Por isso, o objetivo deste material é apresentar de forma concisa os principais fundamentos que permitem um estudante de graduação compreender o funcionamento do equipamento e se interessar em aprender esse assunto
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    Acesso aberto (Open Access)
    Identificação de ceramidas livres em Leishmania (Viannia) braziliensis
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-08-31) Brisque, Barbara Raquel Munaretti [UNIFESP]; Takahashi, Anita Hilda Straus [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5581342220032436; http://lattes.cnpq.br/2993371822176736; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Leishmania (Viannia) braziliensis, agente etiológico da leishmaniose cutânea, mucosa e mucocutânea, sofre modulações distintas (pH e temperatura), de acordo com o microambiente do hospedeiro. Na busca por potenciais moléculas-alvo no âmbito terapêutico, estudos recentes demonstram a importância do metabolismo de esfingolipídeos na biologia da L. braziliensis. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi analisar o efeito da temperatura e do pH na viabilidade, morfologia e no perfil esfingolipídico do parasita. Para tais análises, foram utilizadas diferentes ferramentas, como citometria de fluxo, microscopia eletrônica de varredura e de transmissão e espectrometria de massas. Quanto à taxa de crescimento do parasita, ela foi semelhante nos parasitas cultivados a 23˚C em meio pH 7,2 (condição controle para promastigotas) e cultivados em condições de estresse isolado de temperatura e pH, enquanto no estresse conjunto de pH e temperatura, ela foi menor. Já em relação à morfologia, os parasitas mantidos a 23 °C apresentaram formato alongado, característico de promastigota, enquanto os mantidos a 35 °C apresentaram características ultraestruturais semelhantes às de amastigotas. Em relação à lipidômica do parasita, pela primeira vez foi demonstrada a presença de ceramidas livres em Leishmania. Ceramida foi analisada por espectrometria de massas com fonte de ionização por electrospray, em modo positivo. Foram observadas as seguintes características na composição de ceramida entre as diferentes condições: nos parasitas controle, os íons majoritários foram os de m/z 540 (d20:0/14:0) e 538 (d20:1/14:0), enquanto no estresse de pH, observou-se um aumento da proporção dos íons contendo base esfingoide d20:1, isto é, íons de m/z 538 (d20:1/14:0) e 566 (d20:1/16:0). A elevação da temperatura de 23 °C para 35 ˚C, mantendo-se o pH 7,2, por sua vez, provocou aumento na proporção do íon de m/z 568 (d20:0/16:0), com redução do íon de m/z 566 (d20:1/16:0). Outras diferenças detectadas entre as diferentes condições de cultivo, como a presença de ceramidas com massas compatíveis com presença de ácidos graxos metilados e hidroxilados, em condições de estresse de pH e temperatura, podem trazer perspectivas para novos alvos terapêuticos.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Implementação de um banco de dados de Leptospira sp. por espectroscopia de massas MALDI-TOF
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017) Karcher, Daniel [UNIFESP]; Juliano, Maria Aparecida [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7909537302983812; http://lattes.cnpq.br/8066390594812786; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Introdução: A caracterização de Leptospira sp. pelo sequenciamento de ARNr 16S é dispendioso e demorado, e além disso, estudos recentes tem mostrado que espécies próximas, como por exemplo L. interrogans e L. kirschneri não são discriminadas. A espectrometria de massa MALDI-TOF (MALDI-TOF MS) é uma ferramenta robusta para identificação de bactérias pela detecção e análise de proteínas ou seus fragmentos permitindo distinguir linhagem de microrganismos ou subespécies. Métodos: para identificação utilizou-se a técnica de espectrometria de massas e métodos de biologia molecular. A criação de espectros de referência e agrupação das linhagens foi feita com o software Biotyper 3.0. Para discriminação dos picos das linhagens patogênicas foi utilizado software ClinProtools. Resultados: nesta tese apresentamos espectros de referência interno de Leptospira sp. usando um banco de dados de referência de Leptospira que foram validadas com uma coleção de isolados brasileiros bem identificados mantidos no Laboratório de Zoonoses Bacterianas no Departamento de Medicina Preventiva Veterinária e Saúde Animal da Universidade de São Paulo. Além disso, L. interrogans e L. kirschneri foram diferenciadas por uma análises de espectrometria de massa em profundidade usando o software ClinProTools. Conclusão: nosso banco de dados interno de espectros de referência tem a precisão necessária para diferenciar espécies patogênicas e não patologias, bem como para distinguem L. interrogans e L. kirschneri.