Navegando por Palavras-chave "Ergosterol"
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- ItemSomente MetadadadosCharacterization and role of the 3-methylglutaconyl coenzyme A hidratase in Trypanosoma brucei(Elsevier Science Bv, 2017) De Lima-Stein, Mariana Leão [UNIFESP]; Icimoto, Marcelo Yudi [UNIFESP]; Levatti, Erica Valadares de Castro [UNIFESP]; Oliveira, Vitor [UNIFESP]; Straus, Anita Hilda [UNIFESP]; Schenkman, Sergio [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Trypanosoma brucei, the agent of African Trypanosomiasis, is a flagellated protozoan parasite that develops in tsetse flies and in the blood of various mammals. The parasite acquires nutrients such as sugars, lipids and amino acids from their hosts. Amino acids are used to generate energy and for protein and lipid synthesis. However, it is still unknown how T. brucei catabolizes most of the acquired amino acids. Here we explored the role of an enzyme of the leucine catabolism, the 3-methylglutaconyl-Coenzyme A hydratase (3-MGCoA-H). It catalyzes the hydration of 3-methylglutaconyl-Coenzyme A (3-MGCoA) into 3-hydroxymethylglutaryl-Coenzyme A (3-HMGCoA). We found that 3-MGCoA-H localizes in the mitochondria) matrix and is expressed in both insect and mammalian bloodstream forms of the parasite. The depletion of 3-MGCoA-H by RNA interference affected minimally the proliferation of both forms. However, an excess of leucine in the culture medium caused growth defects in cells depleted of 3-MGCoA-H, which could be reestablished by mevalonate, a precursor of isoprenoids and steroids. Indeed, procyclics depleted of the 3-MGCoA-H presented reduced levels of synthesized steroids relative to cholesterol that is scavenged by the parasite, and these levels were also reestablished by mevalonate. These results suggest that accumulation of leucine catabolites could affect the level of mevalonate and consequently inhibit the sterol biosynthesis, required for T. brucei growth. (C) 2017 Elsevier B.V. All rights reserved.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Composição de Microdomínios de Membrana de Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum: Importância na infectividade de macrófagos alveolares(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2009-03-25) Tagliari, Loriane [UNIFESP]; Takahashi, Helio Kiyoshi [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Biological membranes are constituted by a mixture of several classes of lipids. In this enviroment, sphingolipids and sterols pack tightly to form together with specific proteins a complex membrane organization known as membrane microdomains. In order to detect the presence of membrane microdomains in yeast forms of pathogenic fungi, such as Paracoccidioides brasiliensis and Histoplasma capsulatum, yeast forms of both fungi were lysed by vortexing with glass beads and then incubated with Brij 98 at 4ºC. Fractions containing membrane microdomains were isolated by ultracentrifugation on sucrose gradient, and their components were analyzed by HPTLC, SDSPAGE and Western blotting. Analysis of membrane lipids showed that about 40% of ergosterol from both P. brasiliensis and H. capsulatum was present in the membrane microdomains, whereas the percentage of glycosphingolipids present in P. brasiliensis and H. capsulatum was 42% and 25%, respectively. Analysis by SDS-PAGE and Western blotting clearly showed a protein enrichment in the membrane microdomains fraction of both fungi. It is noteworthy the presence of Pma1p, a fungal microdomain marker, and also the presence of a 30 kDa (glyco)protein which binds to laminin. To investigate the requirement of ergosterol to mantain the integrity of membrane microdomains, it was used methylbeta- cyclodextrin (mβCD) an agent able to efficiently extract membrane sterols. After treatment of yeasts using mβCD, it was observed the removal of 80% and 70% of ergosterol in P. brasiliensis and H. capsulatum, respectively. After treatment with mβCD it was observed a shift of 25% of the glycosphingolipids from the insoluble to the soluble fraction, conversely the distribution profile of phospholipids remained unmodified after treatment with mβCD. The protein analysis showed the displacement of a few proteins to soluble fractions of the sucrose gradient, such as Pma1p and the (glyco)protein of 30 kDa. On the other hand, using an anti-α5-integrin antibody it was detected, even after the mβCD treatment, the presence of a 50 kDa protein in membrane microdomains, suggesting the existence of microdomains that do not depend on ergosterol for their integrity. These data strongly suggest the existence of two population of microdomains: i) dependent of ergosterol for integrity maintenance of microdomains and ii) microdomains non-dependent of ergosterol for the maintenance of their functional role. Furthermore, the biological importance of membrane microdomains was clearly demonstrated by a 53% reduction of infectivity of alveolar macrophage infectivity when yeast forms of H. capsulatum were treated with mβCD.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Membrane microdomain components of Histoplasma capsulatum yeast forms, and their role in alveolar macrophage infectivity(Elsevier B.V., 2012-03-01) Tagliari, Loriane [UNIFESP]; Toledo, Marcos Sergio de [UNIFESP]; Lacerda, Tanil G [UNIFESP]; Suzuki, Erika [UNIFESP]; Straus, Anita Hilda [UNIFESP]; Takahashi, Helio Kiyoshi [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Analysis of membrane lipids of Histoplasma capsulatum showed that similar to 40% of fungal ergosterol is present in membrane microdomain fractions resistant to treatment with non-ionic detergent at 4 degrees C. Specific proteins were also enriched in these fractions, particularly Pma1p a yeast microdomain protein marker (a plasma membrane proton ATPase), a 30 kDa laminin-binding protein, and a 50 kDa protein recognized by anti-alpha 5-integrin antibody. To better understand the role of ergosterol-dependent microdomains in fungal biology and pathogenicity, H. capsulatum yeast forms were treated with a sterol chelator, methyl-beta-cyclodextrin (m beta CD). Removal of ergosterol by m beta CD incubation led to disorganization of ergosterol-enriched microdomains containing Pma1p and the 30 kDa protein, resulting in displacement of these proteins from detergent-insoluble to -soluble fractions in sucrose density gradient ultracentrifugation. m beta CD treatment did not displace/remove the 50 kDa alpha 5-integrin-like protein nor had effect on the organization of glycosphingolipids present in the detergent-resistant fractions. Ergosterol-enriched membrane microdomains were also shown to be important for infectivity of alveolar macrophages; after treatment of yeasts with m beta CD, macrophage infectivity was reduced by 45%. These findings suggest the existence of two populations of detergent-resistant membrane microdomains in H. capsulatum yeast forms: (i) ergosterol-independent microdomains rich in integrin-like proteins and glycosphingolipids, possibly involved in signal transduction; (ii) ergosterol-enriched microdomains containing Pma1p and the 30 kDa laminin-binding protein; ergosterol and/or the 30 kDa protein may be involved in macrophage infectivity. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.
- ItemAcesso aberto (Open Access)Quantificação de ergosterol como método de confirmação do padrão de susceptibilidade de amostras de Candida tropicalis a fluconazol(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006) Silva, Thelma Alves da [UNIFESP]; Colombo, Arnaldo Lopes [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)Introdução: A literatura registra grande variação nos índices de resistência a fluconazol observadas em amostras de Candida tropicalis, com índices de 0 a 35%. Esta variação faz supor que o fenômeno in vitro conhecido como "trailing", que é caracterizado pela inibição parcial de inóculo na presença de drogas fungistáticas, esteja sendo interpretado como resistência. Devido a essa discrepância de resultados, Arthington-Skaggs e cols.,(1999), sugeriram a técnica de quantificação de ergosterol para determinar valores de CIMs em cepas que apresentam "trailing". Objetivos: 1.Descrever o perfil de susceptibilidade de cepas de C. tropicalis isoladas de episódios de fungemia frente a fluconazol, 2.Avaliar a prevalência de cepas de C. tropicalis com o fenótipo "low-high MICs" observados em leitura após 24 e 48 horas de incubação e 3.Utilizar a quantificação de ergosterol como ferramenta para descriminar cepas verdadeiramente resistentes a fluconazol entre aquelas com "trailing". Material e Métodos: Foram incluídas 224 cepas de C. tropicalis provenientes de episódios de candidemia que foram encaminhados ao Laboratório Especial de Micologia, durante o período de 2000 a 2005. Após triagem de C. albicans, utilizando-se meio cromogênico CHROMagar- Candida, os isolados de Candida não-albicans foram identificados por análise do perfil bioquímico pelo método comercial ID32C e análise de microcultivo. O perfil de susceptibilidade das amostras frente à fluconazol foi realizado pelo método de microdiluição em caldo, de acordo com a normatização do documento do CLSI M27-A2 (2002). Os valores de CIMs foram obtidos nas leituras após 24 e 48 horas de incubação, utilizando critérios visuais e espectrofotométricos. A metodologia padrão utilizada para quantificar ergosterol de células fúngicas foi realizada de acordo com a técnica desenvolvida por Arthington-Skaggs e cols., 1999. Resultados: O perfil de susceptibilidade das 224 cepas de C. tropicalis frente à fluconazol foi analisado pelo método de microdiluição em caldo, de acordo com o documento CLSI M27-A2 (2002). Com relação às leituras realizadas após 24 horas de incubação, os valores de CIM50 foram de 0,5µg/mL para a leitura espectrofotométrica e 1,0 µg/mL para a leitura visual. Já os valores de CIM90 foram de 4,0µg/mL para a leitura espectrofotométrica e 8,0 µg/mL para leitura visual. Com relação às leituras realizadas após 48 horas de incubação, os valores de CIM50 e CIM90 foram de 2,0µg/mL nas duas leituras e os valores de CIM90 foram de 8,0µg/mL também nos dois critérios de leitura. Houve uma concordância entre os resultados das leituras visual e espectrofotométrica de 96,87% e 98,21% após 24 e 48 horas de incubação, respectivamente. O fenômeno de trailing esteve presente em apenas 87 (38,83%) isolados após 24 horas de incubação, sendo que destas 9 (10,35%) foram classificados como trailing moderado/intenso. Já em relação às leituras realizadas após 48 horas de incubação, 118 (52,67%) isolados apresentaram crescimento de trailing e 32 (27,11%) foram classificados como trailing moderado/intenso. Todas as 20 (8,92%) cepas que apresentaram valores CIMs ≥16µg/mL em qualquer leitura após 24 horas de incubação foram submetidas à quantificação de ergosterol de suas membranas, em ensaios com exposição a diferentes concentrações de fluconazol. Destes 20 isolados, 17 (85%) foram considerados sensíveis (CIMs ≤4µg/ml) e apenas 3 (15%) isolados foram considerados resistentes (CIMs ≥64µg/ml) pela técnica de quantificação de ergosterol. Conclusões: 1. As leituras visuais e espectrofotométricas de ensaios com fluconazol apresentam grande semelhança de resultados; 2. O fenômeno de trailing moderado/intenso é muito freqüente com cepas de C tropicalis, dificultando a interpretação dos resultados; 3. A grande maioria (85%) das 20 amostras inicialmente identificadas como resistentes nos ensaios de microdiluição apresentaram redução de ergosterol em suas membranas quando expostas a droga, mostrando tratar-se de trailing; 4. Tais dados sugerem que a ocorrência de cepas de C. tropicalis verdadeiramente resistentes a fluconazol seja bem menos freqüente que o sugerido na literatura.
- ItemSomente MetadadadosRelação entre o estado fisiológico, o conteúdo de ergosterol E 24(28)-dehidroergosterol e a sensibilidade aos antibióticos poliênicos em diferentes espécies de leveduras(Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 1978) Shimizu, Mario Tsunezi [UNIFESP]; Alterthum, Flávio [UNIFESP]