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    Alterações bioquímicas e celulares secundárias à deficiência enzimática em modela animal de Mucopolissacaridose tipo I
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2011-03-30) Pereira, Vanessa Gonçalves [UNIFESP]; D'Almeida, Vânia [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença de depósito lisossômico autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima alfa-L-iduronidase, responsável pela degradação de dois glicosaminoglicanos: dermatan e heparan sulfatos. Pacientes com MPS I apresentam uma ampla diversidade de manifestações clínicas e, até hoje, não foi possível estabelecer a correlação genótipo-fenótipo. Além disso, somente o acúmulo de glicosaminoglicanos não é suficiente para explicar a heterogeneidade fenotípica. A ampla diversidade de manifestações clínicas é uma característica das doenças de depósito lisossômico, além do acúmulo de metabólitos não diretamente relacionados à deficiência enzimática específica, sugerindo que várias vias bioquímicas e/ou celulares secundárias estejam envolvidas na fisiopatologia destas doenças. Alterações em diversos processos celulares como vias de sinalização, homeostase de Ca2+ intracelular, biossíntese de lipídeos, tráfego intracelular, permeabilização da membrana lisossômica e autofagia já foram identificadas em diferentes doenças de depósito lisossômico. Neste presente estudo, foram avaliados os processos de permeabilização da membrana lisossômica, homeostase de Ca2+ intracelular e autofagia em diferentes tecidos de um modelo animal de MPS I. Em esplenócitos de camundongos com MPS I, foi observada maior quantidade de Ca2+ no retículo endoplasmático e nos lisossomos, e menor quantidade de H+ nos lisossomos, indicando alteração de homeostase iônica nestas células. Foi observada também uma alteração na distribuição de H+ entre os compartimentos celulares, além da presença de cisteíno proteases no citosol, que evidenciam o processo de permeabilização da membrana lisossômica. Além disso, os esplenócitos de camundongos com MPS I apresentaram taxa maior de apoptose, provavelmente ativada pela permeabilização. Em conjunto, essas alterações sugerem que o processo de autofagia também possa estar comprometido neste modelo animal. Em relacao aos marcadores de autofagia, foi observada maior quantidade da proteina Beclina-1 no cerebro dos camundongos com MPS I, indicativo de inducao da autofagia. Nao foram observadas evidencias de acumulo de agregados proteicos pelo bloqueio de autofagia em nenhum dos tecidos estudados (cerebro, figado e baco), pois nao foram encontradas diferencas nas quantidades da proteina p62/SQSTM1. Porem, foi identificada uma isoforma da p62/SQSTM1 de menor tamanho, e a razao entre as isoformas foi diferente entre todos os tecidos, sugerindo que o fluxo de degradacao destas moleculas e tecido-especifico. Alem disso, foram observados baixos niveis de ƒÀ-tubulina nos hepatocitos dos camundongos com MPS I, que provavelmente causam desorganizacao do citoesqueleto e deficiencia no transporte vesicular. Analisados de maneira conjunta, os resultados observados neste presente estudo demonstram que diversas alteracoes bioquimicas e celulares secundarias a deficiencia enzimatica estao envolvidas na fisiopatologia da MPS I, e que essas alteracoes sao tecido-especificas.
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    Alteracoes no reticulo endoplasmatico e na mitocondria induzem autofagia e apoptose em astrocitos imortalizados
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2011) Terashima, Juliana Yoshie [UNIFESP]
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    Atividade antileucêmica de compostos bioativos e possível efeito sinérgico quando combinados aos inibidores de tirosina quinase
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-12-20) Silva, Janaina Peixoto da [UNIFESP]; Trindade, Claudia Bincoletto [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6169006634951828; http://lattes.cnpq.br/4854038360574252; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Objetivo: Avaliar a atividade antileucêmica dos compostos bioativos (Cianidina 3-glicosídeo, Ácido Clorogênico e Curcumina) a fim de realizar um screening inicial para possível associação desses aos Inibidores de tirosina quinase (Imatinib e Nilotinib) em linhagem de células K-562 e em células de medula óssea de pacientes com LMC. Métodos: As células K-562 foram avaliadas quanto aos níveis de espécies reativas de oxigênio, morte celular caspase-dependente, ativação de BAX e tBID, níveis proteicos de BCR-ABL, p62 e LC3II, modulação farmacológica da autofagia com Cloroquina e sileciamento do gene Beclina, bem como o estudo de marcadores CD11b e CD15. Além disso, foi realizado o estudo da capacidade clonogênica em células de medula óssea de pacientes com LMC. Resultados: A Curcumina (25µM) foi mais citotóxica para células K-562 quando comparado aos outros compostos bioativos estudados neste trabalho, por essa razão, foi escolhida para seguir com os experimentos. A associação deste composto ao Nilotinib, em baixa concentração (15 uM), promoveu um aumento de morte celular com ativação de BAX e tBID, o qual foi revertido na presença do Z-VAD (inibidor de pan caspase), sugerindo o envolvimento do processo de morte celular caspase-dependente em células K-562. O estudo da participação da autofagia, demonstrou que a inibição farmacológica promoveu morte celular, sugerindo que a autofagia estaria envolvida com o processo de resistência, após a exposição a Curcumina 15µM. Esses achados foram confirmados pelos estudos de Western Blot com deteceção de LC3II e p62. A redução da capacidade clonogência de células leucêmicas pela Curcumina e associação Nilotinib+Curucmina, foi evidenciada nos ensaios clonais com células de pacientes com LMC. Interessante notar que o extrato de Curcuma longa, o qual apresenta a Curcumina e outros curcuminóides em sua constituição, apresentou dados similares a Curcumina quanto ao potentical citotóxico em células K-562. Conclusão: Esses dados sugerem que a Curcumina e a associação deste ao Nilotinib apresentaram potencial antileucêmico significativo. Além disso, a Curcumina promoveu ações similares ao Nilotinib quanto a redução da capacidade clonogênica em células de medula óssea de pacientes, evidenciando assim o seu potencial terapêutico.
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    Autofagia mediada pelo canabidiol em modelo de Doença de Parkinson em Caenorhabditis elegans
    (Universidade Federal de São Paulo, 2024-06-28) Kano, Rodrigo Issamu [UNIFESP]; Pereira, Gustavo José da Silva [UNIFESP]; Trindade, Claudia Bincoletto [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/616900663495182; http://lattes.cnpq.br/7125107888186769; https://lattes.cnpq.br/8098981250558712
    O envelhecimento é o fator de risco primário para doenças neurodegenerativas como a Doença de Parkinson (DP). Muitos indivíduos acometidos pela DP recebem tratamento farmacológico paliativo que ajudam a controlar as manifestações clínicas da doença, porém, sem inibir sua progressão. Neste contexto, embora o canabidiol (CBD) tenha sido cada vez mais estudado na DP, devido a seus efeitos no sistema nervoso central e por apresentar efeitos neuroprotetores, o seu mecanismo de ação ainda não está totalmente elucidado. Muitas evidências apontaram para um papel do CDB na indução da autofagia em vários modelos celulares e animais. Sabe-se que a deficiência da autofagia leva ao acúmulo citosólico de agregados proteicos ubiquitinados, que são características importantes de processos neurodegenerativos, como os corpos de Lewis na DP, que são formados principalmente pela proteína α-sinucleína. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estudar a ação do CBD em modelos in vivo da Doença de Parkinson, avaliando a modulação da termotolerância, o papel da autofagia e uma possível via de ação HLH-30/TFEB. Foram utilizados modelos de C. elegans transgênicos, para expressão de GFP::LGG-1 e GFP::HLH-30, para a avaliação das proteínas LC3 e TFEB, respectivamente. A microscopia de fluorescência foi utilizada para avaliar os efeitos do CBD na formação de pontuações e a translocação de HLH-30/TFEB para o núcleo para avaliar uma possível indução da autofagia através da ativação do HLH-30/TFEB após o tratamento de CBD. Verificou-se também a possível modulação do CBD na longevidade pelo ensaio de termotolerância em diferentes concentrações, CBD 0,1 µM, CBD 0,5 µM, CBD 1 µM, CBD 5 µM e CBD 100 µM. Os dados obtidos por microscopia de fluorescência sugeriram a ativação do fluxo autofágico pela via TFEB após o tratamento com CBD a 100 μM por 2 horas. Dessa forma, esse estudo contribui para uma melhor compreensão sobre os potenciais alvos terapêuticos canabinoides e como perspectiva futura um possível papel neuroprotetor.
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    Avaliação da neuroproteção mediada pelo estrógeno em modelo celular de tauopatia
    (Universidade Federal de São Paulo, 2020-06-05) Oliveira, Rafaela Brito [UNIFESP]; Ureshino, Rodrigo Portes [UNIFESP]; Bassani, Taysa Bervian [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5259525243493475; http://lattes.cnpq.br/7174742745591377; http://lattes.cnpq.br/6092763044260412
    Nos últimos anos, relatórios apontam que a população de idosos continuará crescendo exponencialmente, e que doenças associadas a velhice devem estar entre as prioridades para o desenvolvimento de novas estratégias de manejo terapêutico. A principal desordem neurodegenerativa associada com essa faixa etária é a Doença de Alzheimer (DA), caracterizada clinicamente pela diminuição da capacidade cognitiva e quadro demencial. Sabe-se que a formação dos emaranhados neurofibrilares, constituídos principalmente pela proteína tau hiperfosforilada, contribui para a patogenia da Doença de Alzheimer e de outras tauopatias, estando estas relacionadas com perda da função neuronal. Como existe maior prevalência da Doença de Alzheimer em mulheres na fase pós menopausa, muitos estudos têm indicado que os estrógenos possuem um papel neuroprotetor e que poderia ser utilizado em processos neurodegenerativos. Assim, intervenções terapêuticas que visem a remoção da proteína tau patológica são desejáveis, como por exemplo, pela modulação da autofagia. O objetivo deste estudo incluiu caracterizar uma linhagem neuronal (SH-SY5Y) que superexpresse a proteína tau humana isoforma 0N4R e a tau mutada P301L, buscando agonistas/antagonistas dos receptores de estrógeno que levem à diminuição da proteína tau superexpressa. Com esta finalidade, foram realizados ensaios in vitro com o modelo celular de tauopatias, avaliando a superexpressão de tau por Western blot, e sua distribuição por meio de microscopia confocal. Os resultados demonstraram que o sistema de expressão induzível Tet On foi eficaz em superexpressar a proteína tau. A análise de lisossomos e mitocôndrias revelou que o modelo celular utilizado para tauopatias neste trabalho de fato causa dano neuronal, pois até mesmo a morfologia de tais organelas foi alterada. O composto Azul de Metileno (MB) demonstrou ser um controle positivo farmacológico para reduzir significativamente os níveis superexpressos da proteína tau. A indução de autofagia foi observada com uso de verapamil nas concentrações de 100µM e 10 µM, dado o aumento da expressão da proteína LC3-II como indicativo de formação de autofagossomos. A ativação do sistema de superexpressão da proteína tau em tempos de 24, 48 e 72 horas não afetou a viabilidade celular, conforme observado por citometria de fluxo com marcação do indicador 7AAD. O screening de uma biblioteca de compostos que agem em receptores nucleares e de membrana do estrógeno (Tocris Bioscience ®) revelou 10 compostos que reduziram em mais de 50% a proteína tau superexpressa em nosso modelo. Os melhores compostos da biblioteca aprovados pelo FDA (Food Drug Administration) foram: letrozol, acetato de bazedoxifeno, anastrozol, tamoxifeno e estropipato. Portanto, a avaliação da regulação dos receptores de estrógeno na citoproteção é relevante para delinear novas terapias farmacológicas para demências, como a que ocorre na Doença de Alzheimer.
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    Avaliação da participação da autofagia na transformação maligna e na resistência à cisplatina em células de melanócito e melanomas murinos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2014-04-30) Antunes, Fernanda [UNIFESP]; Smaili, Soraya Soubhi [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6368730022418127; http://lattes.cnpq.br/4094866581034271; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O melanoma é um dos tipos de câncer com alta taxa de mortalidade devido à baixa efetividade dos tratamentos atualmente disponíveis. Uma das abordagens terapêuticas mais utilizadas consiste no uso de quimioterápicos como a cisplatina. Entretanto, as células tumorais desenvolvem diversos mecanismos de resistência causando baixa eficácia do tratamento. Atualmente, tem-se proposto que a autofagia, uma via catabólica lisossomal envolvida na reciclagem de macromoléculas e organelas danificadas, seja um dos mecanismos de sobrevivência das células tumorais sob estresse genotóxico. Estudos demonstram que a autofagia também participa do processo de tumorigênese. Em estágios iniciais, a autofagia age primordialmente como um mecanismo de supressão do desenvolvimento tumoral, uma vez que limita danos ao DNA. Entretanto, uma vez o tumor estabelecido, a autofagia apresenta um papel pró-tumoral, possibilitando a sobrevivência das células tumorais nas condições de estresse do microambiente, fornecendo intermediários para síntese proteica e produção de energia necessária para sustentar a elevada taxa proliferativa dessas células. Dessa forma, o objetivo geral do presente trabalho foi estudar a participação da autofagia na transformação maligna de melanócitos murinos (melan-a) a melanomas (4C11- e Tm5). Além disso, investigar a possível inter-relação entre autofagia e quimioresistência no tratamento com cisplatina. Para tanto, utilizou-se o modelo de transformação maligna de melanócitos não tumorigênicos (melan-a) a melanoma não metastático (4C11-) e metastático (Tm5). As três linhagens foram submetidas ao meio sem nutrientes e fatores de crescimento (EBSS), como indutor de autofagia, e aos tratamentos com cloroquina (CQ - inibidor autofágico), cisplatina (CDDP) e a associação de CDDP com EBSS ou CQ. A avaliação do processo autofágico foi realizada por citometria de fluxo com acridine orange, microscopia de fluorescência após transfecção com o plasmídeo GFP-LC3 e western blotting para a proteína p62. Também foi avaliada a morte celular por meio de citometria de fluxo com marcação de iodeto de propídeo (PI) e marcação de anexina V-FITC e PI. Os resultados mostraram que há um aumento da autofagia e uma diminuição da morte celular conforme a progressão tumoral do melanoma. Além disso, as células tumorais apresentam autofagia basal aumentada em relação aos melanócitos. O tratamento com cisplatina induziu autofagia em todas as linhagens, sendo maior nas células mais resistentes à morte celular. Já a associação de CDDP e EBSS, apresentou efeito sinérgico na indução de autofagia e potencializou a efetividade da cisplatina, principalmente no melanoma metastático (Tm5). A associação de CDDP e CQ potencializou a efetividade da cisplatina no melanoma não-metastático (4C11-). Os resultados indicam que, no modelo em estudo, a autofagia participa do processo de tumorigênese, além de ser um mecanismo de resistência ao tratamento com cisplatina. Ademais, reforça a idéia de que a modulação da autofagia pode ser utilizada como uma terapia adjuvante no tratamento de tumores refratários à morte celular como os melanomas. Esse estudo também abre a perspectiva para a utilização da restrição e/ou privação nutricional como uma estratégia de baixo custo e de fácil acesso no tratamento do melanoma in vivo, principalmente em seu estágio metastático
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    Avaliação dos efeitos da manose em células de melanoma humano
    (Universidade Federal de São Paulo, 2020-10-13) Martinelli, Matheus Utrilla [UNIFESP]; Zelanis, André Palitot Pereira [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/8149569348608834; http://lattes.cnpq.br/5610242852890019
    A elevada demanda energética imposta pelo processo oncogênico tem importantes consequências no metabolismo de células cancerosas, bem como tem impacto expressivo nos métodos de diagnóstico e terapias associadas ao tratamento de neoplasias. A manose é um epímero da glicose e, portanto, é absorvida pelos mesmos transportadores que a glicose. Trabalhos recentes utilizando linhagens celulares tumorais demonstraram que este epímero da glicose se acumula nas células como manose-6-fosfato (M6P), devido à baixa expressão da enzima fosfomanose isomerase (PMI), que converte M6P em frutose-6-fosfato (F6P), um intermediário da via glicolítica. Esta característica tem impacto significativo no metabolismo da glicose pela via glicolítica, ciclo tricarboxílico e via das pentoses fosfato. Neste trabalho, focamos no estudo do efeito da manose sobre diversos processos celulares, como o crescimentocelular, a autofagia, a glicosilação de proteínas, o ciclo celular e morte celular programada. Para isso foram realizados ensaios de curva de crescimento das culturas, separação de proteínas do secretoma em resina de Concanavalina-A e posterior SDS-PAGE para identificação de proteínas glicosiladas, western blotting da proteína LC3-II, identificação de Organelas Vesiculares Ácidas (AVO’s) por citometria de fluxo para o estudo de autofagia e análise do ciclo celular (proporção G0G1/G2M) e morte celular programada (% SubG1) por citometria de fluxo. Observou-se que as linhagens celulares tratadas com manose apresentaram redução significativa no crescimento celular. Também foi observado um acréscimo na produção de AVO’s e células em morte celular programada (SubG1) nos grupos tratados exclusivamente com manose. Entretanto, não foi capaz de se observar aumento de proteínas glicosiladas secretadas, diferença significativa de proteína LC3-II no lisado e nem alterações significativas no ciclo celular das células que foram tratadas com manose.
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    Caracterização das proteínas parceiras de Ape4, Ams1 e Atg8 durante o processo de autofagia em Cryptococcus neoformans: estudo sobre os impactos na virulência e sensibilidade aos antifúngicos
    (Universidade Federal de São Paulo, 2019-10-23) Roberto, Thiago Nunes [UNIFESP]; Vallim, Marcelo Afonso [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/4039129182586680; http://lattes.cnpq.br/4906645347015121
    A criptococose é uma micose de caráter sistêmico de grande importância clínica. A doença é causada, sobretudo, pelo complexo Cryptococcus neoformans, na qual, está associado principalmente a pacientes imunodeficientes. O tratamento dessa micose compreende o uso de fármacos que, geralmente, são tóxicos para o paciente. Assim sendo, futuras pesquisas precisam ser desenvolvidas visando identificar novos alvos/estratégias de tratamento e controle da doença. Por sua vez, a elucidação das vias autofágicas em fungos pode fornecer novos entendimentos sobre as relações estabelecidas para garantir o processo de infecção. A autofagia é um sistema de degradação e reciclagem intracelular de macromoléculas e organelas, essencial para a sobrevivência da célula em condições adversas. Em Saccharomyces cerevisiae, durante o processo de autofagia do tipo Cvt (Cytoplasm to vacuole targeting) há a participação de cinco principais proteínas, sendo que, a espécie C. neoformans é capaz de codificar apenas três dessas proteínas, isto é: Ape4, Ams1 e Atg8. Por esta razão, este projeto teve como objetivo analisar quais proteínas interagem com Ape4, Ams1 e Atg8 em C. neoformans, verificando seus respectivos papéis no mecanismo da autofagia e, também, em eventos não autofágicos. Utilizando a metodologia de dois-híbridos, conseguimos identificar e confirmar a interação de Atg8 com a proteína Os-9. Os resultados mostraram que a deleção do gene OS-9 não interferiu no desenvolvimento celular para as condições analisadas. Além disso, confirmamos experimentalmente para C. neoformans a interação física descrita na literatura entre as proteínas Atg8 e Atg3, Atg4 e Atg7. Ainda, os resultados mostraram que os genes ATG4 e ATG8 são fundamentais para a sobrevivência da célula em privação nutricional; o transporte e proteólise intravacuolar da proteína Atg8 é dependente de Atg4; os mutantes atg4 e atg8 são mais tolerantes ao estresse oxidativo, sensíveis ao corante vermelho de Congo e ao inibidor de proteassoma bortezomibe (BTZ). Concluímos assim que as interações de Atg8 para a sua conjugação com fosfatidiletanolamina (PE) e regulação da via da autofagia encontram-se conservadas em C. neoformans.
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    Caracterização do fármaco Mirabegron no metabolismo lipídico: Relação entre a termogênese e a autofagia
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-01-18) Monteiro, Filipe Vieira Martins [UNIFESP]; Pereira, Gustavo José da Silva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7125107888186769; http://lattes.cnpq.br/3296747743765518
    O Mirabegron é um fármaco seletivo para os receptores β3, os adrenoceptores β, particularmente o do subtipo β3 no tecido adiposo marrom, quando estimulados com catecolaminas, como a noradrenalina, tem papel relevante na estimulação da lipólise e da termogênese por meio da proteína termogenina (UCP1), regulando os níveis de gotas lipídicas. Este trabalho investiga os efeitos no metabolismo lipídico e da termogênese mediados pelo Mirabegron em adipócitos murinos marrons e avalia o papel da autofagia nesse processo. Para tanto, foram utilizadas metodologias para quantificação e avaliação de proteínas relacionadas ao processo autofágico, avaliação da expressão gênica e proteica relacionadas à lipofagia e à termogênese.
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    Cryptococcus neoformans: papel da proteína Vps34 sobre os fatores de virulência e resistência a estresses osmótico, salino e oxidativo
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-12-06) Sousa, Guilherme Oliveira de [UNIFESP]; Vallim, Marcelo Afonso [UNIFESP]; Padilla, Adrián Adolfo Álvarez [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5182785443286188; http://lattes.cnpq.br/4039129182586680; http://lattes.cnpq.br/4639977859922958
    A criptococose é uma doença de grande importância clínica, quando se diz respeito a doenças infecciosas oportunistas. Dados afirmam que há cerca de 250.000 casos por ano, sendo que as taxas de mortalidade chegam a 60%. Sendo assim, o estudo dos mecanismos que conferem virulência ao fungo causador da doença devem ser analisados, a fim de se explorar novas possibilidades de alvos terapêuticos para tratamentos mais eficazes e que não sejam tóxicos ao paciente. Contudo, a colonização do hospedeiro pela levedura gera a necessidade do microorganismo se adaptar ao ambiente e poder explorá-lo de forma a obter nutrientes que garantem o seu estabelecimento e proliferação. Entretanto, para se estabelecer até obter os nutrientes externos, as células devem realizar processos que reciclam seus componentes disponibilizando nutrientes para a mesma, o que é crucial nesta etapa. A via de autofagia é um desses mecanismos importantes para a reciclagem de nutrientes. Previamente, nosso grupo de pesquisa mostrou que proteínas que fazem parte desta via possuem relação com a virulência deste fungo, por meio de mutantes que demonstraram ser avirulentos e mais sensíveis aos medicamentos existentes para o tratamento da criptococose. Assim, este trabalho teve como objetivo aprofundar os estudos sobre a relação de autofagia e virulência avaliando o papel da ausência da proteína Vps34 em C. neoformans. Essa proteína é responsável pela formação de dois complexos protéicos, um capaz de localizar e regular o tráfego de proteínas intracelulares, através de eventos de fosforilação de proteínas e lipídios para o vacúolo de degradação, e outro capaz de contribuir para a formação do autofagossomo pelo recrutamento de outras proteínas estruturais. Portanto, foi avaliado o mutante vps34Δ, o qual teve o gene selvagem (VPS34) deletado para aferir o impacto da ausência de Vps34 sobre a patogênese de C. neoformans. A partir dele, foram realizados testes como resistência a estresses com meios de cultura suplementados com agentes estressores para cada tipo de estresse, crescimento à temperatura fisiológica humana a partir de curvas de crescimento e à produção de fatores de virulência com meios de cultura contendo os precursores para a síntese desses fatores, os quais são alterados no mutante vps34Δ. Assim, foi possível observar que este mutante apresenta grande sensibilidade aos fatores estressantes e baixa produção dos fatores de virulência, tendo virulência atenuada em modelo animal. Deste modo, podemos concluir que a proteína Vps34 é um fator importante para a sobrevivência de C. neoformans em condições adversas o que torna essa proteína um alvo possível para o desenvolvimento de novas opções terapêuticas.
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    Desenvolvimento, caracterização e estudos da autofagia e apoptose em modelo celular de doença de Parkinson
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2018-08-30) Erustes, Adolfo Garcia [UNIFESP]; Smaili, Soraya Soubhi [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6368730022418127; http://lattes.cnpq.br/4111992747501625; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Parkinson’s disease (PD) is a chronic progressive disease characterized by the death of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the brain region. The main pathological feature of PD is the presence of cytoplasmic protein aggregates called Lewy Bodies, whose main component is the protein αsynuclein (αsyn). It is a protein with functions that remain poorly understood, however it might act in exocytosis of neurotransmitters vesicles and in regulation of mitochondrial physiology and morphology. This protein is predominantly found in wild type (WT) conformation, however mutations in the gene that encodes αsynuclein (SNCA) have been described as generating mutant species, such as A30P and A53T, both of which related to autosomal dominant cases of PD. The accumulation and aggregation of these proteins in the cytoplasm of neurons may cause mitochondrial dysfunction, cells stress, and cell death. Transglutaminase2 (TG2) is an enzyme that demonstrates an important role in the generation of protein aggregates in neurodegenerative diseases and mediates crosslink reactions of proteins. The aim of this work was to establish a neuronal cellular lineage overexpressing the αsyn (WT, A30P and A53T) and verify the occurrence mitochondrial dysfunctions, changes in mitochondrial membrane potential and Ca2+ homeostasis, as well as the mitochondrial accumulation of these proteins. For this purpose, western blot analysis, coimmunoprecipitation assays, as well as real time, space fluorescence, and confocal microscopy were used. The data showed that αsynucleins formed aggregates in cellular cytoplasm, mainly in the presence of TG2, and can mediate this process, by facilitating the oligomerization of these proteins. The aggregates were partially colocalized with mitochondria, affecting the mitochondrial membrane potential, deregulation in homeostasis, and mitochondrial Ca2+ accumulation. An increase in activation of the mitophagy pathway was also seen in cells overexpressing the mutants asyn A30P and A53T. In addition, the overexpression of αsyn promoted decrease in autophagic activity and the inhibition of protein degradation that causes accumulation of monomers and oligomers of αsyn. This data suggests that failures in protein degradation pathways influence the oligomerization and accumulation of αsyn; and that TG2, may also have some influence in this process. In addition, the cytoplasmic accumulation of αsyn affects mitochondrial physiology, mitochondrial membrane potential and interferes with Ca2+ homeostasis, especially in the presence of mutated αsyn A30P and A53T.
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    Efeito em longo prazo do estresse subcrônico nos processos de sobrevivência e morte celular em coração de ratos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2020-06-03) Santos, Marco Antonio Cordeiro Carvalho Dos [UNIFESP]; Spadari, Regina Celia [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo
    Due to the modern lifestyle, more and more people have been exposed to stress. During the stress reaction, the hypothalamic-pituitary-adrenal axis secretes glucocorticoids and the sympathetic nervous system- adrenal medulla releases catecholamines. As a result, β adrenoceptors (β-ARs) are overstimulated. In the heart of mammals, two subtypes of β-ARs, β1-ARs and β2-ARs, are mainly expressed in a 80:20 ratio. In the heart of rats subjected to foot shock stress, as well as in senescent heart and failing heart, there is a reduction in the β1/β2-AR ratio. The consequences of this change have been studied by our research group. However, it was not known yet whether such changes triggered by stress are long lasting. In this study, we propose to assess whether changes in the cardiac adrenoceptors induced by stress remain in the medium term and whether there are any consequences of these changes in the processes of cell death, atrophy and autophagy. The data showed that stress has transitory effects on β2-AR and β1-AR population but persistent effects on proteins of the intracellular signaling pathways related to cardiomyocytes survival such as reduction of autophagy (Lc3-II and Rab7) and atrophy (MurF1) markers, as well as in the concentration of hydrogen peroxide up to 5 days after stress. At the same time, the expression of markers of protective processes, such as BCL2 and SIRT3, are increased 5 days after stress. It is concluded that stress has transitory effects on the expression of the β-AR population but triggers a more persistent stimulation on proteins of the intracellular signaling pathways related to cardiomyocyte survival and autophagy.
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    Efeitos da inibição da via autofágica na indução da apoptose e na síntese de espécies reativas de oxigênio em oócitos bovinos expostos à hiperglicemia
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-01-27) Reis, Veronica Louzada [UNIFESP]; Lopes, Fabíola Freitas de Paula [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/0954914266701996; http://lattes.cnpq.br/0604096975417271
    O diabetes mellitus (DM) é uma das enfermidades que mais acomete a população humana. A hiperglicemia induzida durante o DM provoca severos danos ao sistema reprodutor. Os oócitos apresentam maior propensão a desbalanços metabólicos ou danos ambientais durante a maturação e são excelentes modelos para investigação dos efeitos da hiperglicemia. Já foi demonstrado que concentrações de glicose acima de ~10 mM no meio de maturação in vitro ativa mecanismos de morte celular, como a apoptose, e induz a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs). Sabe-se que a autofagia atua como um mecanismo de sobrevivência em condições de estresse, entretanto, pouco se sabe sobre os efeitos deletérios da inibição da autofagia em células germinativas expostas à hiperglicemia. Dessa forma, este projeto fez uso do sistema de maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos como modelo a fim de determinar o papel da autofagia durante a MIV de oócitos expostos à hiperglicemia na síntese de EROs, na progressão meiótica e na indução de apoptose oocitária. Portanto, complexos cumulus-oócitos (CCOs) foram incubados com o inibidor da autofagia (0 ou 10 mM 3-metiladenina – 3-MA) em meio contendo concentrações de 5,5 (grupo controle) ou 20 mM (grupo hiperglicêmico) de glicose durante 21 horas de MIV. Os CCOs foram desnudados após a MIV e dividido em dois grupos. Para o primeiro experimento, parte dos oócitos foi utilizada para determinação de células apoptóticas pelo ensaio de TUNEL e análise da progressão meiótica para metáfase II (MII). A hiperglicemia e a inibição da autofagia não afetaram a porcentagem de células apoptóticas. No entanto, a presença de 3-MA na MIV reduziu a porcentagem de oócitos em MII nos grupos com 5,5 mM (P= 0,0312) e 20 mM de glicose (P= 0,01410). O segundo experimento determinou os níveis de EROs nos oócitos a partir do ensaio Cell ROX Green. A hiperglicemia aumentou a síntese de EROs em comparação aos demais grupos (P= 0,0029). Além disso, houve uma tendência de aumento da produção de EROs no grupo hiperglicêmico com 3-MA (P= 0,0769). Os resultados indicaram que os oócitos foram comprometidos pela hiperglicemia por meio do aumento do estresse oxidativo e pela inibição da autofagia, reduzindo a maturação nuclear. É possível que esses danos celulares comprometam a qualidade oocitária, reduzindo a fertilidade.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Efeitos do treinamento resistido sobre atrofia muscular induzida pela privação de sono paradoxal
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2013) Mônico-Neto, Marcos [UNIFESP]; Mello, Marco Tulio de [UNIFESP]; Antunes, Hanna Karen Moreira [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/1464519773053362; http://lattes.cnpq.br/4215971444001756; http://lattes.cnpq.br/7363798736559248; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
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    Acesso aberto (Open Access)
    Envolvimento da via autofágica no envelhecimento bem-sucedido
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-09-30) Chaves, Carolina Fioroto [UNIFESP]; D'Almeida, Vania [UNIFESP]; Mazzotti, Diego Robles [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6848696921553394; http://lattes.cnpq.br/7220411418339421; http://lattes.cnpq.br/2107925110083483; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O envelhecimento é um fenômeno no qual há o declínio dos processos essenciais para a sobrevivência celular. As principais vias que mantem a limpeza e a homeostase celular são a autofagia e o proteassomo. Investigamos estas vias em três diferentes grupos de indivíduos: Jovens (20-30 anos), Idosos (60-70 anos) e Longevos (80-105 anos) por meio da quantificação do proteassomo no plasma e da expressão de genes relacionados à maquinaria autofágica em sangue periférico. Nos níveis do proteassomo quantificados no plasma, não foram encontradas diferenças significativas entre os três grupos estudados, assim como não foram encontradas correlações entre os níveis de proteassomo e as idades dentro de cada grupo. Com relação à via autofágica, foi medida a expressão de 84 genes, sendo que destes, apenas 5 foram diferencialmente expressos: ATG4C (codifica proteína com atividade de protease, envolvido na formação do vacúolo autofágico; responsável pelo transporte de proteínas e; responsável pelas proteínas alvo da membrana/vacúolo) BCL2L1 (co-regulador da autofagia e apoptose), TP53 (co-regulador da autofagia e do ciclo celular; co-regulador da autofagia e apoptose), EIF2AK3 (co-regulador da autofagia e apoptose e indutor da autofagia por patógenos intracelulares) e EIF4G1 (regulador da autofagia em resposta a outros sinais intracelulares). Foi feita também análise de rede e de enriquecimento para observar as interações entre os genes diferencialmente expressos e os processos nos quais eles estão envolvidos. Observamos uma interação entre quatro dos cinco genes diferencialmente expressos, e a participação destes genes, seja direta ou indiretamente, no processo transcricional, sugerindo que a transcrição possa estar afetada pelo processo de envelhecimento. Foi verificado que os Longevos apresentaram tanto uma manutenção da expressão dos genes ligados à maquinaria autofágica, quanto uma manutenção dos níveis de proteassomo, em relação ao grupo Idoso, fatores estes que podem ser importantes para um envelhecimento bem-sucedido.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo da autofagia e dos mecanismos de morte após privação nutricional para quimiosensibilização de modelos de melanoma humano Wild Type e Braf V600e
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2018-06-28) Antunes, Fernanda [UNIFESP]; Smaili, Soraya Soubhi [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6368730022418127; http://lattes.cnpq.br/4094866581034271; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O melanoma metastático, embora seja o menos prevalente dentre os tipos de câncer de pele, é o mais letal por ser extremamente resistente aos tratamentos atualmente disponíveis, tornando a busca por novas abordagens terapêuticas urgentemente necessárias. Embora a exposição à radiação UV represente a principal causa da melanomagênese, estudos recentes evidenciam também a presença de várias mutações genéticas, como BRAFV600E, presente em aproximadamente 70% dos melanomas, e que promove a ativação constitutiva da via RASRAFMAPK, levando à proliferação celular descontrolada. Esta mutação também está relacionada à inativação de vias de morte celular, desregulação de autofagia, indução de estresse de retículo e favorecimento do metabolismo glicolítico. que coletivamente resultam em resistência a qualquer tratamento. Recentemente foi demonstrado que alterações na dieta podem influenciar tanto o desenvolvimento como o tratamento de diversos tipos de câncer. Um dos protocolos em estudo consiste em ciclos de restrição severa de nutrientes associados a agentes antitumorais. Entretanto, os mecanismos moleculares responsáveis pelos efeitos quimiossensibilizantes ainda não foram completamente elucidados. Baseado nessas premissas, o objetivo geral deste trabalho foi estudar os efeitos da privação nutricional em combinação com terapias antitumorais para o tratamento do melanoma metastático. Para tanto, linhagens de melanoma humano BRAFWT e BRAFV600E e melanoma murino foram submetidas à avaliação qualiquantitativa de morte celular após privação nutricional e/ou tratamento com cisplatina ou sorafenibe. Observouse que, independetemente do status mutacional de BRAF, a privação nutricional sensibilizou as linhagens de melanoma aos tratamentos antitumorais. A morte celular foi predominantemente apoptótica, com determinante participação da mitocôndria no processo de morte celular. Além disso, o bloqueio da glicólise potencializou os efeitos da privação nutricional associada tanto à cisplatina como ao sorafenibe. Adicionalmente, a privação nutricional e os tratamentos antitumorais, isoladamente, induziram autofagia. No entanto, quando associada privação nutricional e sorafenibe, houve bloqueio dos estágios finais do processo autofágico, que assim como o cotratamento com cloroquina, sensibilizou as linhagens de melanoma à morte celular. Já a análise in vivo demonstrou que o uso de intermittent fasting foi seguro e efetivo em reduzir o crescimento tumoral quando associado ao tratamento com sorafenibe. Além disso, foi observada indução de autofagia nos tecidos tumoral e hepático após intermitente fasting e sorafenibe, mas não na sua associação. Coletivamente, nossos resultados indicam que a privação nutricional em associação a agentes antitumorais pode representar uma nova abordagem terapêutica no tratamento do melanoma metastático tanto BRAFWT como BRAFV600E.
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    Estudo da autofagia mediada por TFEB: desvendando um papel para os receptores Two-Pore Channels
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2020-12-18) Guarache, Gabriel Cicolin [UNIFESP]; Pereira, Gustavo Jose Da Silva [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo
    Autophagy is a lysosomal catabolic process that degrades and recycles intracellular components in response to cellular stress. One of important regulator of this process is the transcription factor EB (TFEB), which is translocated to the nucleus through the lysosomal Ca2+ release and further activates the transcription machinery related to lysosomal biogenesis and autophagy genes. Recent studies have demonstrated that the Ca2+ signals from the endolysosomal system mediated by the newly second messenger NAADP (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate) via Two-Pore Channels (TPCs) activation induces autophagy. Since TFEB activation and consequent autophagy induction by TPCs signaling are dependent on lysosomal Ca2+, this present study investigated the possible participation of the TFEB on TPCs-mediated autophagy in HeLa cell line. For this purpose, firstly, was verified that autophagy was induced by NAADP-AM [100 nM], a membrane permeant analog of NAADP, accompanied by decrease in TFEB cytosolic levels during 4 hours. In HeLaGFP-TFEB cells, NAADP-AM [100 nM] for 1 hour induced TFEB nuclear translocation, whereas Ned-19 [10 μM], a NAADP non-competitive antagonist, inhibited autophagy, increased TFEB cytosolic levels and decreased nuclear/cytosolic TFEB ratio. To evaluate the possible participation of TPCs on TFEB translocation, cells overexpressing Myc-TPC1 or Myc-TPC2 were treated with NAADP-AM [100 nM] for 1 hour. As result, TPC1-overexpressing cells treated with NAADP-AM [100 nM] as well as the TPC2-overexpressing cells were able to translocate TFEB to the nucleus. Furthermore, TFEB translocation induced by starvation was potentiated by TPCs overexpression, especially in TPC2-overexpressing cells. Taken together, these results indicated that TFEB subcellular localization can be modulated by Ca2+/TPCs cell signaling in response to NAADP and starvation. The comprehension of the underlying mechanisms associated to TFEB-mediated autophagy is important for potential therapeutic targets in several diseases.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo da autofagia modulada pelo Canabidiol em modelos celulares de infecção por SARS-CoV-2
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-02-14) Araujo, Beatriz Grisolia [UNIFESP]; Pereira, Gustavo José da Silva [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7125107888186769; http://lattes.cnpq.br/3452685876406431
    A autofagia é um processo catabólico endolisossomal altamente regulado e fundamental para a manutenção da homeostase celular. Evidências sugerem grande potencial da modulação da autofagia no tratamento da infecção por SARS-CoV-2, devido a estratégias adotadas pelo mesmo para modular esse mecanismo e usá-lo de modo pró-viral. O canabidiol (CBD), fitocanabinóide presente abundantemente na planta Cannabis sativa, tem sido reportado como um possível tratamento à COVID- 19, no entanto, o mecanismo autofágico mediado pelo CBD nesse contexto está em discussão. Neste presente estudo, avaliou-se o papel da modulação da autofagia, a partir do CBD, na infectibilidade de duas linhagens celulares (Vero-E6 e Beas-2B) ao SARS-CoV-2. A partir dos resultados obtidos pelo PCR em tempo real, demonstrou- se que a concentração de CBD [1 μM] foi a mais efetiva em diminuir o número de cópias virais em ambos modelos celulares, com as variantes B 1.1.7 ou Ômicron. Além disso, os níveis de expressão de ECA2 e TMPRSS2 não foram modulados pelo CBD, exceto ECA2 na concentração [10 μM] onde há uma diminuição da sua expressão, além de, aparentemente, não influenciarem no número de cópias virais. Por fim, através da técnica de Western Blotting, observou-se um aumento dos níveis de LC3II e p62 devido a infecção pelo SARS-CoV-2 Ômicron. Adicionalmente, o CBD foi capaz de diminuir os níveis de p62 a partir das concentrações de [1 μM] e [10 μM], evidenciando que o SARS-CoV-2 estaria possivelmente bloqueando a fase final da autofagia a seu favor e que o CBD tem potencial de reverter esse processo a partir da modulação autofágica. Dessa forma, esse estudo adiciona importantes informações sobre o potencial terapêutico do CBD, além de elucidar o papel da autofagia na COVID-19. Palavras-chave: SARS-CoV-2, Canabidiol, Autofagia.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo da modulação dos compostos canabinoides na autofagia: possível neuroproteção em modelos celulares para doença de Alzheimer
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-04-12) Vrechi, Talita Aparecida de Moraes [UNIFESP]; Pereira, Gustavo José da Silva [UNIFESP]; Ureshino, Rodrigo Portes [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/7174742745591377; http://lattes.cnpq.br/7125107888186769; http://lattes.cnpq.br/0678547525838381
    O fitocanabinoide canabidiol (CBD) é um composto canabinoide não psicotrópico presente na planta Cannabis sativa, que tem sido reportado por suas diversas ações terapêuticas por diferentes mecanismos, incluindo a ativação autofágica. A autofagia é um processo catabólico lisossomal responsável por degradar componentes citosólicos, como organelas disfuncionais e proteínas malformadas ou agregadas, sendo essencial para a homeostase e sobrevivência celular. Estudos apontam que nas doenças neurodegenerativas ocorre disfunção no processo de autofagia, levando ao acúmulo de proteínas e causando diversos tipos de doenças. Dentre as mais prevalentes e associadas ao envelhecimento está a doença de Alzheimer (DA), em que há a presença da proteína tau hiperfosforilada em regiões cerebrais afetadas, como o córtex e hipocampo. No entanto, a hiperfosforilação dessa proteína também pode ser encontrada em outras doenças neurodegenerativas chamadas de tauopatias. Neste contexto, a modulação da autofagia tem sido estudada como um possível alvo terapêutico para o tratamento de doenças neurodegenerativas. Estudos apontam o papel modulador e neuroprotetor do sistema canabinoide em modelos in vivo e in vitro de neurogeneração, porém a sinalização celular mediada pelos compostos canabinoides nos processos autofágicos ainda não foi completamente elucidada. Neste trabalho foram investigados os efeitos do CBD na autofagia em uma linhagem de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) e em uma linhagem de astrócitos murinos. A partir dos resultados obtidos, demonstrou-se que o CBD (10 µM) ativou a autofagia através dos receptores CB1, CB2 e TRPV1 pela regulação das vias ERK1/2 e PI3K/AKT, que são reguladores da sobrevivência e proliferação celular. É interessante notar que, a ativação da autofagia mediada pelo CBD foi dependente do complexo ULK1/2, mas independente de mTORC1, sendo assim plausível afirmar que uma via não canônica esteja envolvida na autofagia. A linhagem que superexpressa a proteína tau de forma induzível também foi utilizada para a avaliação do possível papel neuroprotetor dos compostos canabinoides. Os resultados demonstraram que o CBD diminuiu a expressão das protéinas AT8 e tau total, sendo que as concentrações de 100 nM e 10 µM ativaram a autofagia, evidenciado pelo aumento da expressão da proteína LC3-II e formação de autofagossomos, demonstrado pelas pontuações de mCherry-LC3. Além disso, os compostos canabinoides CBD, ACEA (agonista CB1) e GW-405833 (agonista CB2) diminuíram a intensidade de fluorescência de EGFP-tau WT; sendo que quando utilizado a cloroquina, um inibidor autofágico, houve uma reversão na intensidade de fluorescência EGFP-tau WT nas concentrações 1 e 10 µM de CBD e 2 µM de GW-405833, demonstrando assim a possível participação da autofagia nesses grupos. Frente os resultados obtidos, foi possível concluir que o CBD induziu a autofagia tanto nas células SH-SY5Y como nas células que superexpressam a proteína EGFP-tau WT. Ademais, os compostos canabinoides aumentaram a degradação da tau, demonstrando assim seu possível papel neuroprotetor. Dessa maneira, este estudo pode contribuir para uma melhor compreensão da autofagia como um potencial alvo terapêutico dos canabinoides em um modelo de neurodegeneração.
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    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo da participação dos receptores de estrógeno na autofagia em modelo celular de taupatia
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-07) Nishino, Michelle Sayuri [UNIFESP]; Ureshino, Rodrigo Portes [UNIFESP]; Stilhano, Roberta Sessa; http://lattes.cnpq.br/2122125365795721; http://lattes.cnpq.br/7174742745591377; http://lattes.cnpq.br/4465659743980035
    Em doenças neurodegenerativas classificadas como tauopatias, há o acúmulo de emaranhados neurofibrilares intracelulares formados principalmente pela proteína tau em seu estado hiperfosforilado. Estudos mostram que a modulação da autofagia é uma das estratégias para o tratamento de demências associadas à formação de agregados proteicos e que a administração de medicamentos para reposição estrogênica pode ter efeito neuroprotetor em processos neurodegenerativos decorrentes do envelhecimento. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a neuroproteção mediada pela participação dos receptores de estrógeno na modulação da autofagia e sua via de ativação molecular em um modelo celular de tauopatia. Os efeitos dos compostos foram observados em um modelo celular de taupatia, que foi desenvolvido a partir da linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, que foi transduzida com os genes eGFP-tau e Tet-on. O sistema Tet-On possibilita a superexpressão da tau apenas na presença da doxiciclina. Os efeitos também foram observados em modelo de taupatia tridimensional, no qual as células com superexpressão de tau foram plaqueadas em esferoides scaffold-free, feitos em matriz de agarose. O screening dos compostos agonistas e antagonistas seletivos dos receptores de estrógeno levou em consideração a viabilidade celular e a capacidade de modular a autofagia. O composto selecionado foi o G15, antagonista do GPER1. Este composto foi avaliado quanto a sua capacidade de reduzir a expressão proteica de tau no modelo de taupatia, demonstrando reduzí-la após 24 horas de tratamento e na concentração de 100 μM. No modelo de neuroesferoides, o composto também se mostrou capaz de reduzir a tau, porém sem apresentar a mesma indução de autofagia. Os resultados encontrados permitem concluir que os compostos estrogênicos representam potenciais indutores de autofagia e que podem ser potenciais agentes neuroprotetores, porém mais experimentos são necessários para afirmar sua efetividade.