Navegando por Palavras-chave "Anoikis"

Agora exibindo 1 - 20 de 20
  • Nenhuma Miniatura disponível
    Item
    Somente Metadadados
    Acquisition of anoikis resistance promotes alterations in the Ras/ERK and PI3K/Akt signaling pathways and matrix remodeling in endothelial cells
    (Springer, 2017) de Sousa Mesquita, Ana Paula [UNIFESP]; Lopes, Silvana de Araujo [UNIFESP]; Pernambuco Filho, Paulo Castanho A. [UNIFESP]; Nader, Helena B. [UNIFESP]; Lopes, Carla Cristina [UNIFESP]
    Anoikis is a programmed cell death induced upon cell detachment from extracellular matrix. Anoikis resistance is a critical mechanism in tumor metastasis. Cancer cells deregulate and adapt their metabolism to survive in the absence of adhesion, spreading metastases to distant organs. These adaptations include abnormal regulation of growth factor receptors activating prosurvival signaling pathways, such as the Ras/ERK and PI3K/Akt pathways, and extracellular matrix remodeling, leading to metastasis by an increase of invasiveness and inhibiting anoikis. This study investigates the possible involvement of ECM components and signaling pathways in the regulation of resistance to anoikis in endothelial cells (EC). Endothelial cells submitted to stressful conditions by blocking adhesion to substrate (anoikis resistance) display an up-regulation of Ras/ERK and PI3k/Akt pathways by high expression of Ras, ERK, PI3K (p110 alpha) and Akt (Thr 308). After ERK and PI3K inhibiting, all EC-derived cell lines studied showed lower growth, a decrease in invasive potential and a higher rate of apoptosis. Furthermore, anoikis-resistant cell lines display a decrease in the expression of fibronectin, collagen IV and hyaluronic acid and an increase in the expression of laminin, perlecan, alpha v, beta 3, alpha 5 and beta 1 integrins subunits, hyaluronidades 1, 2 and 3 and metalloproteinases 2 and 9. These results indicate that the acquisition of anoikis resistance induced remodeling of the extracellular matrix and overexpression of the PI3K/Akt and Ras/ERK pathway components. Acquisition of resistance to anoikis is a potentially crucial step in endothelial cell transformation.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Associação entre Timp1, β1-integrinas e CD63 ao longo da gênese do melanoma
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2010-11-24) Pinto, Mariana Toricelli [UNIFESP]; Jasiulionis, Miriam Galvonas [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Although malignant melanoma is the less frequently diagnosed skin cancer, it shows a poor prognosis due its chemoresistance and metastasis development. One of the adquired abilities of transformed cells is anoikis resistance and this property is closely related to metastasis formation. In our laboratory, we developed a model that allows us to study different steps of melanocyte malignant transformation. Melan-a melanocytes surviving after 1, 2, 3 and 4 deadhesion cycles showed modified morphology and independent PMA growth and have been named, 1C, 2C, 3C and 4C cells, respectively. Different melanoma cell lines were established after submitting 4C spheroids to limiting dilution. Previous results of our group showed increased expression of Timp1 along melanoma genesis and its correlation with anoikis resistance. However, the mechanism involved in this signaling is unknown. Published data demonstrated interaction between CD63, Timp1 and 1-integrins in human breast epithelial cells and its role in apoptosis. Furthermore, aberrant glycosylation in cell adhesion molecules such as integrins provides to cells the ability to survive under anchorage-independent conditions. The aim of this work was analyze the possible interaction among CD63, Timp1 and 1-integrins along melanocyte malignant transformation, possible aberrant N-glycosylation patterns of β1-integrins and their impact in anoikis resistance. Aberrant N-glycosylation patterns were observed in tumorigenic cells. We observed interaction between CD63 and Timp1 and between CD63 and 1-integrins in the melan-a-derived cells 4C, 4C11, and 4C11 +, and interaction between Timp1 and 1-integrins only in melanoma cell lines 4C11 - and 4C11 +. The presence of Timp1 in supernatant from 4C11+ conferred to melan-a cells anoikis resistance. The expression of 1-integrins in our study model is increased in aggressive melanoma lineage, 4C11+, as well as the expression of Mgat-V and aberrant N-glycosylation on cell surface. Moreover, the electrophoretic profile of  1-integrin suggests that melanoma metastatic 4C11+. Lineage present increased aberrant N-glycosylation in this molecule. Treatment of melanoma cells 4C11 + with the N-glycosylation inhibitor, swainsonine, resulted in reduced capacity of these cells to resist to anoikis. This seems to be the first study describing the interaction between Timp1, CD63 and 1-integrin in tumor cells and may contribute to a better understanding of how Timp1 regulates resistance to anoikis during the melanocyte malignant transformation.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Avaliação funcional do gene PIK3CA (fosfatidilinositol-3-quinase, subunidade catalítica alfa) em células endoteliais resistentes ao Anoikis
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2019-12-18) Mesquita, Ana Paula De Sousa [UNIFESP]; Azevedo, Carla Cristina Lopes De [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/5059789790144996; http://lattes.cnpq.br/5059789790144996; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The development, differentiation and homeostasis of adherent cells are controlled by cell-cell, cell-extracellular matrix (ECM) and cell-soluble factors interactions. The loss of these contacts induces to anoikis, an apoptosis specific type. Tumor cells acquire resistance to anoikis, survival after loss of anchorage and invasion of the vascular system, colonizing distant organs. This process is called metastasis. Activation of the PI3K / Akt signaling pathway is the most common mechanism involved in the acquisition of anoikis resistance by cancer cells. Thus, this pathway represents an opportunity and a challenge for cancer therapy. Previous studies from our group reported that the acquisition of anoikis resistance by endothelial cells from rabbit aortic trigger morphological changes, high proliferation rate, poor adhesiveness to fibronectin, laminin and collagen IV, high invasiveness, low apoptosis rate, and dysregulation of cell cycle. In addition, anoikis resistant cell lines exhibit up-regulation of the Ras/ERK and PI3K/Akt pathways. This is accompanied by an extensive remodeling of the MEC. The role of PI3K in cancer was highlighted by the observation that the gene encoding the p110α catalytic subunit is often mutated in the most common human cancers. In this study, we aim to elucidate the role of the p110α catalytic subunit PI3K protein in the acquisition of the anoikis-resistant phenotype and in the regulation of cellular characteristics directly related to tumorigenesis such as apoptosis rate, cell proliferation, adhesiveness, invasiveness and PI3K p110α downstream cellular signaling. For this purpose, we performed the gene silencing of PIK3CA, that gene encodes the PI3K catalytic subunit p110α. Anoikis-resistant endothelial cells (Adh1-EC) subjected to PIK3CA gene silencing originated the cell lines miR-PIK3CA-Adh1-EC 1 e miR-PIK3CA-Adh1-EC 2. Those cell lines shown a reversal in characteristics associated with malignancy: decrease in anoikis resistance and cell proliferation rate, increase in apoptosis rate and caspases 3, 7, 8 activity, increased fibronectin adhesiveness, however, collagen IV and laminin adhesion rates were not altered. This was accompanied by a decrease in invasive capacity, reduction in gene and protein expression of Akt (phosphorylated on threonine 308 and serine 473), mTOR (phosphorylated on serine 2448), PTEN and H-Ras. A reduction in ERK gene expression was also observed, but this reduction xxi was not reflected in the ERK1/2 protein levels phosphorylated on the residues threonine 202 and tyrosine 204, threonine 185 and tyrosine 187. In summary, silencing of only one subunit of the PI3K family, p110α, showed good results in reversing the anoikis-resistant phenotype of endothelial cell. These results provide a molecular basis for the design of new therapies for the treatment of metastatic cancers. This strategy may help overcome apoptosis resistance in aberrantly PI3K / Akt pathway cancers.
  • Nenhuma Miniatura disponível
    Item
    Somente Metadadados
    Brown spider (Loxosceles intermedia) venom triggers endothelial cells death by anoikis
    (Elsevier B.V., 2012-09-01) Nowatzki, Jenifer; Sene, Reginaldo Vieira; Paludo, Katia Sabrina; Rizzo, Luiz Eduardo; Souza-Fonseca-Guimaraes, Fernando; Veiga, Silvio Sanches; Nader, Helena Bonciani [UNIFESP]; Franco, Celia Regina C.; Trindade, Edvaldo S.; Univ Fed Parana; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Estadual Univ Parana
    Brown spider (Loxosceles sp.) venom affects the endothelium of vessels and triggers disruptive activity in the subendothelial matrix. the vascular disorders observed after venom exposure include leukocyte and platelet activation, disseminated intravascular coagulation, an increase in vessel permeability and hemorrhage into the dermis. in this study, we report additional evidence regarding the mechanism of endothelial cell cytotoxicity induced by Loxosceles intermedia venom. Exposure to venom led to endothelial cell detachment in a time-dependent manner. Loss of cell anchorage and cell-cell adhesion following venom exposure was accompanied by changes in the distribution of the alpha(5)beta(1) integrin and VE-cadherin. An ultrastructural analysis of cells treated with venom revealed morphological alterations characteristic of apoptosis. Moreover, after venom exposure, the ratio between Bax and Bcl-2 proteins was disturbed in favor of Bax. in addition, late apoptosis was only observed in cells detached by the action of venom. Accordingly, there was no increase in apoptosis when cells were exposed to L. intermedia venom in suspension, suggesting that the loss of cell anchorage provides the signal to initiate apoptosis. Thus. L. intermedia venom likely triggers endothelial cell death indirectly through an apoptotic mechanism known as anoikis. (C) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.
  • Nenhuma Miniatura disponível
    Item
    Somente Metadadados
    Efeito da resistência à morte celular por perda de adesão (anoikis) na expressão do sindecam-4 e no ciclo celular de células endoteliais em cultura
    (Universidade Federal de São Paulo, 2013-04-25) Carneiro, Bruna Ribeiro [UNIFESP]; Azevedo, Carla Cristina Lopes de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Tumors produce several molecules that facilitate their proliferation, invasion and maintenance, especially proteoglycans. The syndecan-4, a heparan sulfate proteoglycan, can act as a co-receptor of growth factors and proteins of the extracellular matrix (ECM) by increasing the affinity of adhesion molecules to their specific receptors. It participates together with integrins and FAK (focal adhesion kinase) in cell adhesion at focal contacts connecting the ECM to the cytoskeleton. Changes in the expression of syndecan-4 have been found in tumor cells, indicating its involvement in cancer. The acquisition of resistance to cell death induced by blockade of adhesion to the substrate (anoikis resistance) is a feature of neoplastic transformation and a critical step during the metastatic process. Aiming to clarify the role of sindecan-4 in the process of anoikis and in the processes of cell transformation, wild endothelial cells (EC) were subjected to transformation induced by blockade of adhesion to the substrate (Adh-EC) and studied in comparison with endothelial cells transfected with the EJ-ras oncogene (EJ-ras EC) in relation to: tumorigenic capacity, adhesive ability, cell cycle, cell proliferation, synthesis and degradation of sulfated glicosaminoglycans (SGAG), expression and localization of syndecam-4 and heparanase expression. After cycles of blocking adhesion, phenotypic changes were observed in the surviving cells. The clones obtained exhibited characteristics similar to tumorigenic cells: multilayer growth, loss of contact inhibition, tumorigenic capacity, uncontrolled cell cycle, differences at the dependence of growth factors present in fetal bovine serum (FBS), decreased adhesive capacity and a major anti-proliferative effect after treatment with specific inhibitors of PI3K/Akt e Ras/Raf/MAPK/ERK pathways. Further, an increase in the synthesis of heparan sulfate (HS) was detected in the clones resistant to anoikis. This increase is observed for both HS chains present in cells and secreted to culture medium. Structural changes in HS chains were also observed. We have seen that there is an increase in the syndecan-4 and heparanase expression in EJ-ras EC and Adh-EC cells. The data suggests that the syndecan-4 is involved in the acquisition of resistance to cell death induced by blockade of adhesion to the substrate (resistance to anoikis), contributing to neoplastic transformation.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Endothelial nitric oxide synthase uncoupling as a key mediator of melanocyte malignant transformation associated with sustained stress conditions
    (Elsevier B.V., 2011-05-15) Melo, Fabiana Henriques Machado de [UNIFESP]; Molognoni, Fernanda [UNIFESP]; Morais, Alice Santana [UNIFESP]; Toricelli, Mariana [UNIFESP]; Mouro, Margaret Gori [UNIFESP]; Higa, Elisa Mieko Suemitsu [UNIFESP]; Lopes, Jose Daniel [UNIFESP]; Jasiulionis, Miriam Galvonas [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Melanoma cell lines and cells corresponding to premalignant melanocytes were established by our group after subjecting a nontumorigenic murine melanocyte lineage, melan-a, to sequential cycles of anchorage blockade. Previous results showed that in melan-a cells the superoxide level increases after such procedure. Superoxide production during melanocyte de-adhesion was inhibited by L-sepiapterin, the precursor of eNOS cofactor BH(4), and increased by the inhibitor of BH(4) synthesis, DAHP, hence indicating a partial uncoupling state of eNOS. the eNOS uncoupling seems to be maintained in cells derived from melan-a, because they present decreased nitric oxide and increased superoxide levels. the inhibition of superoxide production in Tm5 melanoma cells with L-sepiapterin reinforces their eNOS-uncoupled state. the maintenance of oxidative stress seems to be important in melanoma apoptosis resistance because Mn(III)TBAP, a superoxide scavenger, or L-sepiapterin renders Tm5 cells more sensitive to anoikis and chemotherapy. More importantly, eNOS uncoupling seems to play a pivotal role in melanocyte malignant transformation induced by sustained anchorage impediment, because no malignant transformation was observed when L-NAME-treated melanocytes were subjected to sequential cycles of de-adhesion. Our results show that uncoupled eNOS contributes to superoxide production during melanocyte anchorage impediment, contributing to anoikis resistance and malignant transformation. (C) 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Estudo das enzimas envolvidas na biossíntese do heparam sulfato e ácido hialurônico em células endoteliais resistentes ao anoikis após silenciamento gênico do sindecam-4
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-08-31) Miranda, Suzany dos Santos [UNIFESP]; Azevedo, Carla Cristina Lopes [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/3825086029138957
    Anoikis é um tipo de morte celular programada desencadeada pela perda de adesão da célula a matriz extracelular ou perda da interação entre as células. A regulação da resistência ao anoikis envolve mecanismos complexos, mas um enfoque promissor tem sido nas enzimas associadas à biossíntese do heparam sulfato (HS) e do ácido hialurônico (AH). Este estudo analisou as enzimas envolvidas na biossíntese de HS e AH, em células endoteliais de aorta de coelho resistentes ao anoikis com o gene sindecam-4 silenciado (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC), por PCR em tempo real, imunodetecção e imunofluorescência. Nossos resultados indicam diminuição na expressão das enzimas Glucuronil C5-Epimerase (GLCE), Heparam Sulfato 2-Sulfotransferase (HS2ST) e Heparam Sulfato 6-Sulfotransferase (HS6ST), Heparam Sulfato 3-Sulfotransferase (HS3ST) e Heparam Sulfato 3-Sulfotransferase 3A1 (HS3ST3A1) após o silenciamento gênico do sindecam-4. Por outro lado, identificamos um aumento na expressão da enzima N-Deacetilase/N-Sulfotransferase (NDST). Em relação as enzimas envolvidas na biossíntese de AH, os dados indicam um aumento na expressão de Ácido Hialurônico Sintase 1 (HAS1) e Ácido Hialurônico Sintase 3 (HAS3), enquanto houve uma redução na expressão da enzima Ácido Hialurônico Sintase 2 (HAS2). Além disso, investigamos a síntese de AH pelo método fluorimétrico elisa-like, onde é possível observar um aumento na síntese de ácido hialurônico nas linhagens silenciadas para o gene do sindecam-4. Esses resultados sugerem o envolvimento das enzimas da biossíntese do HS e AH na transformação celular e aquisição da resistência ao anoikis.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Estudos dos efeitos de concentrações crescentes de óxido nitrico no processo de morte por perda de adesão ao substrato (Anoikis): o papel desempenhado no processo pela proteína Src quinase
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017-05-30) Costa, Paulo Eduardo da [UNIFESP]; Monteiro, Hugo Pequeno [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6154759166234850; http://lattes.cnpq.br/2047870426131771; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The study of cell death induced by loss of adhesion (anoikis) is essential to understand how metastatic tumor cells may develop resistance to this type of cell death. Among a number of factors that can influence anoikis, nitric oxide has your role little known in relation to this issue. In adhered cells, it is known that nitric oxide induces cellular proliferation at low concentrations, as well as induces cell death after the treatment with high concentrations. However, in our study, we observed that detached cells behave in a different mode when treated with increase concentrations of NO: Low concentrations of NO induces drop on cell viability in detached HeLa cells, as well as increase levels of cleaved caspase-3. Since high concentrations of NO induces anoikis protection, with increase on cell viability, decreased of caspase-3 cleavage and decrase of expression of Bim protein. Src kinase has been shown to have key role in this mechanism, being phosphorylated and nitrosylated following treatment with high concentrations of NO. Inhibition of Src, can reverse this protection induced by high concentrations of NO with respect to cell viability and expression of Bim protein.These viability results were reproduced in Nex8H metastatic melanomas, but not in non metastatic melanomas Nex10C. In HeLa cells kept in suspension, NO in high concentrations induced cell disaggregation in a Src dependent manner. NO-dependent disaggregation can be reproduced in murine melanoma cells Nex8H and Nex10C. Increasing concentrations of NO decreased the effectiveness of reattachment of HeLa cells kept in suspension. Src kinase showed no role in the process. We know that tumor cells often produce high concentrations of NO. This study shows up as a first step in understanding how these cells can migrate from a primary to a secondary source and got to readhere regarding the role of increasing concentrations of NO in the process.
  • Nenhuma Miniatura disponível
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Expressão de glicosaminoglicanos sulfatados e proteoglicanos de heparam sulfato em células endoteliais resistentes ao anoikis após tratamento com trastuzumabe
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2017) Onyeisi, Jessica Oyie Sousa [UNIFESP] ; Azevedo, Carla Cristina Lopes de [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/0546695375822929; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Objetivo: Avaliar o efeito do trastuzumabe (Tmab) na expressão de glicosaminoglicanos sulfatados e proteoglicanos de heparam sulfato em células endoteliais resistentes ao anoikis. Métodos: Células endoteliais de aorta de coelho (EC), EC resistentes ao anoikis (Adh-EC) e EC transfectada com o oncogene EJ-ras (EJ-ras EC) foram tratadas com trastuzumabe e analisadas em relação a: capacidade adesiva, invasão, proliferação, angiogênese, ciclo celular, expressão e localização do sindecam-4, expressão de perlecam e síntese de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs). Resultados: Os resultados demonstraram que as células endoteliais anoikis-resistentes apresentam maior adesão à fibronectina e menor capacidade invasiva, proliferativa e angiogênica, após tratamento com trastuzumabe. Observamos também que, após o tratamento com o trastuzumabe, houve um aumento significativo no número de células na fase S do ciclo celular. Em relação à expressão do sindecam-4, perlecam e síntese de heparam sulfato (HS), observamos uma diminuição tanto na expressão do sindecam-4 e perlecam, bem como na biossíntese de HS nas células endoteliais resistentes ao anoikis após exposição ao Tmab. Por outro lado, as células endoteliais selvagens apresentaram aumento significativo na expressão de perlecam e na síntese de HS. Conclusão: Juntos, os resultados sugerem que o trastuzumabe não interage apenas com HER2, mas com glicosaminoglicanos e proteoglicanos tanto de superfície celular, como da matriz extracelular, e também, controla eventos celulares das células endoteliais resistentes ao anoikis.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Expressão de moléculas da matriz extracelular em células endoteliais resistentes ao anoikis
    (Universidade Federal de São Paulo, 2016-04-19) Lopes, Silvana de Araujo [UNIFESP]; Azevedo, Carla Cristina Lopes de [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    The extracellular matrix (ECM) is a structure composed of several macromolecules that are differently distributed among tissues of organisms. The interaction between ECM molecules and receptors present on the cell membrane affect several cell properties, including migration, proliferation, differentiation and apoptosis.The process of apoptosis by loss of cell adhesion is named anoikis. This process is considered an important mechanism in preventing independent growth of cell adhesion, because it difficult the binding of cells to inappropriate matrix, thus preventing the colonization of other tissues. However, resistance to anoikis is a critical step in tumor progression and metastasis.Because of the importance and complexity of cell-cell and cell-ECM interactions, studies on the ECM components have important relevance because it represents progress in the development of new drugs for the treatment of cancer.Thus, we studied the expression and localization of various ECM molecules in endothelial cells derived from rabbit aorta (EC), EC transfected with EJ-ras oncogene (EJ-ras EC) and EC resistant to anoikis (Adh1-EC e Adh2-EC).The results show that there was a decrease in the expression of fibronectin, collagen IV and hyaluronic acid as well as an increase in the expression of perlecam, laminin, integrinsαvβ3 and α5β1, MMPs-2 and -9 and hyaluronidases 1, 2 and 3 in anoikis resistant and transfected endothelial cells in relation to parental cells. These results suggest that changes in ECM molecules expression can be directly related to the acquisition of resistance to anoikis in endothelial cells.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular em células endoteliais resistentes ao anoikis submetidas ao silenciamento gênico do sindecam-4
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-08-08) Ferreira, Bianca Zaia Franco [UNIFESP]; Lopes, Carla Cristina [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/6435149792172510
    Introdução e Objetivo: A remodelação da arquitetura do citoesqueleto durante o ciclo celular é crucial para uma divisão precisa. Apesar da importância do sindecam-4 (SDC4) em diversos eventos celulares, seu papel específico na desregulação do ciclo celular em células tumorais ainda não está completamente elucidado. Este trabalho buscou entender o papel do sindecam-4 na progressão e regulação do ciclo celular e no remodelamento do citoesqueleto em células endoteliais resistentes ao anoikis. Métodos: Células endoteliais selvagens (EC), EC resistentes ao anoikis (Adh1-EC), EC resistentes ao anoikis silenciadas para o gene do sindecam-4 (Adh-shRNA-Syn4-EC) e EC transfectadas com o oncogene EJ-ras (EJ-ras EC) foram estudadas em relação à expressão de proteínas reguladoras expressas nas diferentes fases do ciclo como: CDKs, ciclinas, os inibidores p21 e p27, além de algumas proteínas do citoesqueleto. A expressão proteica foi avaliada por meio das técnicas de Western Blotting e Citometria de Fluxo, enquanto a análise do RNAm foi conduzida utilizando a técnica de qPCR. Além disso, a localização das proteínas foi investigada por meio da técnica de imunofluorescência, e a viabilidade celular foi avaliada por meio de um ensaio de resistência ao anoikis. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando o programa GraphPad Prism 6, com valor de significância p<0,05. Resultados: O silenciamento gênico do sindecam-4 diminuiu a taxa de proliferação. Isso ocorreu por meio da alta expressão de p27 e baixa expressão do complexo ciclina E-CDK2, que impedem a célula de avançar ao ponto R em direção a fase S do ciclo celular, confirmado pela diminuição da ciclina B1. Conclusões: O silenciamento do sindecam-4 resultou em um aumento na suscetibilidade das células ao processo de anoikis, indicando que sua regulação pode representar um alvo terapêutico promissor. Essa descoberta evidencia a capacidade do sindecam-4 em modular os processos relacionados ao desenvolvimento do câncer, destacando sua relevância como um potencial alvo terapêutico no combate a essa doença.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    A expressão de Timp1 associada à desmetilação de seu promotor confere resistência ao anoikis durante a transformação maligna de melanócitos murinos
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2008) Ricca, Tatiana Iervolino [UNIFESP]; Jasiulionis, Miriam Galvonas [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    Embora a resistência ao anoikis seja considerada um importante processo envolvido no fenótipo maligno, a relação causal entre transformação neoplásica e crescimento independente de ancoragem continua indefinida. Para estudar essa correlação, foi desenvolvido em nosso laboratório um modelo experimental de transformação maligna de melanócitos murinos, em que melanócitos melan-a foram submetidos a ciclos seqüenciais de bloqueio de ancoragem. Ao longo deste processo, foram estabelecidas tanto linhagens celulares correspondendo a fases intermediárias da progressão tumoral como linhagens de melanoma, as quais são progressivamente resistentes ao anoikis e representam fases distintas da progressão tumoral. Análises de expressão gênica mostraram aumento da expressão de Timp1 nas linhagens de melanoma quando comparadas à linhagem parental de melanócitos. Ainda que descrita como inibidora de MMPs, essa proteína foi recentemente associada à resistência ao anoikis em células epiteliais de mama humana. Deste modo foram analisadas neste trabalho: 1) a relação entre expressão de Timp1 e aquisição do fenótipo resistente ao anoikis e 2) a possível regulação epigenética da expressão de Timp1 por metilação de DNA neste modelo. Enquanto células melan-a expressam baixos níveis de Timp1, todas as linhagens derivadas desta expressam níveis elevados desta proteína. O tratamento dos melanócitos melan-a com o agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina resultou em aumento significativo da expressão de Timp1. De fato, a análise pelo ensaio Methylation sensitive-Single Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE) mostrou aumento progressivo na desmetilação do gene Timp1 em paralelo a sua crescente expressão ao longo da transformação maligna. A superexpressão de Timp1 em células melan-a resultou no aumento da sobrevivência das mesmas em condições independentes de ancoragem, mas foi incapaz de transformá-las. Além disso, o tempo de latência para o aparecimento de tumores foi menor para células de melanoma transfectadas com Timp1, indicando que esta molécula pode estar associada com a agressividade do tumor. Esses resultados mostram aumento da expressão de Timp1 durante a transformação maligna, em decorrência da desmetilação gênica progressiva, associado ao aumento da resistência ao anoikis, mas não à aquisição de um fenótipo maligno transformado.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Mecanismos de resistência à morte por Anoikis mediada por óxido nítrico em células de melanoma humano
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-09-02) Nascimento, Igor Ribeiro [UNIFESP]; Monteiro, Hugo Pequeno [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6154759166234850; https://lattes.cnpq.br/1961250538154082
    O melanoma caracteriza-se pelo crescimento descontrolado dos melanócitos. E, embora seja menos comum do que outros tipos de câncer de pele (American Cancer Society, 2021) é a forma mais mortal entre eles, exibindo padrões de desenvolvimento extremamente agressivos. Sua taxa de sobrevida em 5 anos é inferior a 5% para os pacientes com melanomas metastáticos para os linfonodos. Um processo de metástase bem-sucedido está associado à capacidade de resistir à morte por perda de adesão ao substrato (anoikis), que melanomas e outros tumores adquirem durante seu desenvolvimento. Dentre uma série de fatores que podem influenciar a morte por anoikis, o papel do óxido nítrico (NO) ainda foi pouco explorado. O NO produzido ou ofertado em baixas concentrações estimula a proliferação de células aderidas a matriz extracelular (MEC).Por outro lado, nestas mesmas condições, o NO produzido ou ofertado em concentrações elevadas pode promover a morte celular. No entanto, em células onde a adesão a MEC foi impedida com indução de morte por anoikis, sabe-se pouco sobre o papel do NO. Nossos primeiros resultados evidenciaram que a utilização de uma superfície de cultivo celular revestida com 20mg/ml de Poli-Hema promovia total incapacidade de adesão das células A375 e SK-MEL-28 de melanoma humano. Estas condições promoviam a morte por anoikis nas células das duas linhagens. As células das duas linhagens quando em suspensão entravam em anoikis em diferentes proporções: Células A375 com mortalidade de 58,6% e células SK-MEL-28 com mortalidade de 34,3%. Utilizamos inicialmente a oferta de NO a partir do doador Detanonoato e a retirada de NO com o uso do seu sequestrador específico, CPTIO. Os resultados obtidos com esta abordagem nos levaram a procurar entender um possível papel para o NO produzido endógenamente pelas duas linhagens. Fizemos uma estimativa de produção endógena de NO e os resultados obtidos mostraram que essa produção nas células A375 se mantinha elevada estando as células aderidas ou mantidas em suspensão. Para as células SK-MEL-28 a produção de NO se encontrava elevada nas células aderidas e diminuída nas células em suspensão. Quando as células eram tratadas com o inibidor geral das enzimas NO sintases (NOS) a viabilidade das células A375 mantidas em suspensão caía de 41,4% para 10,6%, enquanto que para as células SK-MEL-28 em suspensão a viabilidade se mantinha inalterada, de 65,7% para 65,5%. Estes resultados demonstraram que NO desempenha papel muito importante na resistência a anoikis apresentada pelas células A375. Por outro lado parece não influenciar na resistência a anoikis apresentada pelas células SK-MEL-28. Com base nesses resultados investigamos as possíveis fontes de NO nas células A375. Nossos resultados sugeriram que uma possível fonte endógena de NO nestas células, utilizável na resistência a anoikis, poderia ser a isoforma NOS3. Em relação aos impactos do NO na expressão das proteínas diretamente relacionadas a anoikis como Bim e a forma clivada/ativa de Caspase 3, não observamos maiores alterações nas células das duas linhagens. Quando analisamos as expressões de proteínas reguladoras da anoikis, Caveolina-1 e a proteína tirosina quinase do complexo de adesão focal (FAK), observamos uma diminuição nos níveis de expressão de Caveolina-1 nas células das duas linhagens mantidas em suspensão. Entretanto, não se observam para as duas linhagens, diferenças entre as três condições experimentais analisadas: células em suspensão; células em suspensão tratadas com PBS (diluente do inibidor das NOSs); células em suspensão tratadas com L-NAME. Os níveis de expressão e de fosforilação da proteína FAK diminuíram nas células A375 mantidas em suspensão e tratadas com L-NAME. Mais ainda, observamos consistentemente em células A375 que as expressões de b-actina e a-tubulina diminuíam quando estas células eram mantidas em suspensão e tratadas com L-NAME. Concluindo, os resultados obtidos neste estudo sugerem a existência de uma via de sinalização celular associada à resistência a anoikis em melanomas humanos de sítio primário, mediada pelo NO. Esta via seria constituída pela proteína tirosina quinase FAK e pelas proteínas constituintes da MEC, b-actina e a-tubulina.
  • Nenhuma Miniatura disponível
    Item
    Somente Metadadados
    Modulação da metilação do DNA por óxido nítrico durante a carcinogênese do melanoma murino
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2005) Campos, Ana Cristina Espindola [UNIFESP]; Carneiro, Célia Regina Whitaker [UNIFESP]
  • Nenhuma Miniatura disponível
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Papel do óxido nítrico (NO) na resistência à morte celular por perda de adesão (anoikis) em células endoteliais em cultura
    (Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2015-09-30) Mesquita, Ana Paula de Sousa [UNIFESP]; Azevedo, Carla Cristina Lopes de [UNIFESP]; ttp://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/5059789790144996; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
    O desenvolvimento, a diferenciação e a homeostase de células aderentes são controlados por interações célula-célula, célula-matriz extracelular (MEC) e célula-fatores solúveis. A perda destes contatos induz a um tipo específico de apoptose, o anoikis. Células tumorais adquirem a capacidade de resistir ao anoikis, sobreviver após a perda de ancoragem e viajar através do sistema vascular, podendo colonizar órgãos distantes. Este processo é denominado de metástase. Várias moléculas podem atuar neste processo, com destaque para o óxido nítrico (NO). Buscando entender o papel do NO no processo de anoikis e nos processos de transformação celular, células endoteliais selvagens (EC), transfectadas com o oncogene EJ-ras (EJ-ras EC) e resistentes ao anoikis (Adh-EC) foram estudadas em relação a: expressão da enzima eNOS, produção de óxido nítrico e a interferência deste em características celulares como proliferação, capacidade adesiva e invasiva e expressão de proteínas das vias de sobrevivência e proliferação PI3K/Akt/mTOR e Ras/Erk. Células endoteliais resistentes ao anoikis (Adh1-EC e Adh2-EC) apresentaram características similares às células tumorigênicas (EJ-ras EC): maior produção de óxido nítrico, maior expressão da enzima eNOS, menor taxa de apoptose, maior capacidade invasiva, menor capacidade adesiva e super expressão de proteínas das vias PI3K/Akt/mTOR e Ras/Erk. Após a inibição da produção de NO, pelo uso de um análogo de arginina (L-NAME), foi possível observar um aumento na capacidade invasiva e uma diminuição da capacidade adesiva, isso foi acompanhado por um aumento na expressão de metaloproteinase 2 (MMP-2). A proliferação celular não foi alterada em nenhuma das linhagens e a taxa de apoptose também não sofreu alteração, exceto para EC. H-Ras e PI3K não tiveram sua expressão alterada. No entanto, os níveis de Fosfo-Akt (Thr308), Fosfo-mTOR (Ser 2448) e Fosfo-Erk 1/2 (Thr202/Tyr204, Thr185/Tyr187) aumentaram significativamente. Os resultados mostram que o NO é capaz de regular a capacidade invasiva e adesiva destas células pela regulação da expressão de MMPs. Acreditamos que a produção de NO está mais elevada em células endoteliais resistentes ao anoikis, não só pela maior expressão gênica e protéica de eNOS, mas também por alterações na ix expressão de proteínas intimamente relacionadas ao processo de fosforilação desta enzima.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Papel do Sindecam-4 na sinalização de células endoteliais resistentes ao anoikis
    (Universidade Federal de São Paulo, 2023-04-19) Machado, Ranyelison Silva [UNIFESP]; Lopes, Carla Cristina [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/1207583472762150
    A morte celular programada por falta de adesão da célula à matriz extracelular é denominada anoikis. Muitas células tumorais são resistentes ao anoikis, o que facilita a invasão dessas células em outros tecidos, assim favorecendo a metástase tumoral. Dados anteriores do nosso laboratório demonstraram que células endoteliais resistentes ao anoikis apresentam alterações morfológicas, alta taxa de proliferação, baixa adesão à fibronectina, laminina e colágeno IV, desregulação do ciclo celular, além de elevado potencial invasivo, baixa taxa de apoptose, aumento na expressão de sindecam-4 e aumento na expressão de PI3K, ERK e H-Ras. Foi demonstrado que o silenciamento gênico do sindecam-4 reverteu o comportamento tumoral das células endoteliais resistentes ao anoikis, diminuindo a capacidade proliferativa, invasiva e angiogênica e aumentando a adesão celular. Esses processos celulares são mediados por vias de sinalização, onde as células estão constantemente enviando e recebendo sinais ao seu redor. Embora alguns estudos tenham demonstrado o papel do sindecam-4 na regulação desses processos biológicos, poucos definiram o papel específico dessa macromolécula na sinalização celular. O objetivo desse trabalho é estudar a expressão das proteínas envolvidas nas vias de sinalização PI3K/AKT e Ras/ERK em células endoteliais da aorta de coelho resistentes ao anoikis, buscando um melhor entendimento do papel do sindecam-4 na regulação da sinalização celular. Para isso, estudamos comparativamente células endoteliais de aorta de coelho (EC), EC transfectadas com oncogene EJ-ras (EJ-ras-EC), células endoteliais de aorta de coelho resistente ao anoikis (Adh-EC) e células endoteliais resistentes ao anoikis (Adh1-EC) que foram transfectadas com micro RNA de interferência para o sindecam-4 (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC). Para o estudo da expressão gênica foi realizada a técnica de qPCR em tempo real (RT-qPCR) e para a expressão proteica foi realizado o ensaio de Western Blotting. A determinação da localização dessas proteínas foi realizada utilizando a técnica de imunofluorescência. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando o programa GraphPad Prism 6, com valor de significância p<0,05. Os resultados demonstraram que as linhagens silenciadas miR-Syn-4-1-Adh-EC e mir-Syn-4-2-Adh-EC apresentaram diminuição na expressão gênica de PI3K, PTEN, AKT, mTOR, H-Ras e ERK em relação às células anoikis resistentes (Adh1-EC). O silenciamento do sindecam-4 levou a uma diminuição na expressão proteica de PI3K total, PI3K (p85), AKT total, mTOR total, H-Ras e p 44/42 MAPK (ERK1/2). E as proteínas PTEN e PI3K (p110α) tiveram aumento na sua expressão nas linhagens silenciadas do estudo. Nas imagens obtidas pela técnica de imunofluorescência foi possível observar uma diminuição da expressão proteica de PI3K, mTOR, H-Ras e ERK nas linhagens miR-Syn-4-1-Adh-EC e miR-Syn-4-2-Adh-EC em relação a Adh1-EC, corroborando com os dados obtidos nos ensaios de Western Blotting. Assim, este estudo revelou que regulação negativa da expressão de SDC4 induziu a modulação das vias PI3K/AKT e Ras/ERK, promovendo a reversão do fenótipo alterado das células resistentes ao anoikis, levando-as a características semelhantes as células EC selvagens. Este estudo identificou o sindecam-4 como um regulador importante da sinalização celular em células resistentes ao anoikis e sugere que sua regulação negativa pode ser uma estratégia promissora para o tratamento do câncer.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Papel do sindecam-4 no remodelamento da matriz extracelular em células endoteliais resistentes ao anoikis
    (Universidade Federal de São Paulo, 2022-03-29) Sousa Onyeisi, Jessica Oyie [UNIFESP]; Lopes de Azevedo, Carla Cristina [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/0546695375822929
    Objetivo: Estudar o papel do sindecam-4 no remodelamento da matriz extracelular e esclarecer suas interações com outras moléculas. Métodos: Células endoteliais de aorta de coelho resistentes ao anoikis submetidas ao silenciamento gênico do sindecam-4 (miR-Syn4-Adh-1-EC) foram estudadas comparando-se com células endoteliais de aorta de coelho resistentes ao anoikis parentais (Adh-EC), células endoteliais de aorta de coelho selvagens (EC) e células endoteliais de aorta de coelho transfectadas com o oncogene EJ-ras (EJ-ras EC), em relação a: migração celular, angiogênese, biossíntese de glicosaminoglicanos sulfatados ao longo do ciclo celular, localização, expressão gênica e proteica das macromoléculas da MEC e das enzimas responsáveis pela degradação da MEC. Foi avaliada ainda a atividade das MMPs, a expressão dos TIMPs e da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), bem como a produção de óxido nítrico (NO). A expressão gênica e proteica dos receptores de superfície celular (integrinas α5β1 e αVβ3) e das moléculas de sinalização celular: quinase de adesão focal (FAK) e SRC também foram analisadas. A migração celular foi avaliada pelo ensaio wound healing, a expressão gênica foi avaliada através da técnica de qPCR, a expressão e localização proteica através das técnicas de western blotting e imunofluorescência, respectivamente, a atividade das MMPs foi avaliada pela técnica de zimografia e a produção de NO foi avaliada pela reação de GREISS. Resultados: O silenciamento SDC4 levou à uma diminuição da migração e da capacidade angiogênica das células endoteliais resistentes ao anoikis. Em comparação com as células parentais (Adh1-EC), as células silenciadas SDC4 (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC) exibiram um aumento na adesão celular à fibronectina. Além disso, a transfecção com miRNA-SDC4 levou a aumento na síntese de heparam sulfato após 12 horas de estímulo com soro fetal bovino (SFB). Após o silenciamento do SDC4, também observamos um aumento na expressão da fibronectina e do colágeno IV e uma diminuição na expressão das integrinas α5β1 e αVβ3. Além disso, as células silenciadas para o SDC4 apresentam um aumento na expressão de Src e FAK. Em relação à expressão das enzimas responsáveis pela degradação da MEC e seus reguladores, nós observamos uma diminuição na expressão da HPSE, da MMP2 e do TIMP2 após o silenciamento do SDC4. Também observamos que o silenciamento do SDC4 causou uma diminuição na produção de óxido nítrico e na expressão de eNOS. Conclusão: Os resultados apresentados ao longo do presente trabalho sugerem que o SDC4 tem um papel importante no remodelamento da matriz extracelular e também representam um passo importante para a compreensão do mecanismo pelo qual o SDC4 pode reverter o fenótipo transformado das células endoteliais resistentes ao anoikis.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Embargo
    Silenciamento gênico do sindecam-4 em células endoteliais resistentes ao anoikis
    (Universidade Federal de São Paulo, 2019-06-14) Pernambuco Filho, Paulo Castanho de Almeida [UNIFESP]; Azevedo, Carla Cristina Lopes de [UNIFESP]; http://lattes.cnpq.br/6280504619546509; http://lattes.cnpq.br/0733903078600862
    A resistência de células tumorais à morte celular por perda de adesão (anoikis) é uma das principais características celulares que contribuem para a progressão e metástase tumoral. Como um fenômeno funcional, a resistência ao anoikis é um importante evento dentro da cascata metastática, sendo um prérequisito para disseminação e colonização em sítios distantes. Entretanto, os mecanismos envolvidos na regulação da resistência ao anoikis ainda não estão completamente elucidados. Várias moléculas estão envolvidas nos processos de sobrevivência, adesão e proliferação celular, entre elas o sindecam-4, um proteoglicano de heparam sulfato (PGHS). Mudanças na expressão do sindecam-4 tem sido comumente encontradas em células tumorais, indicando o seu envolvimento no câncer. Assim, para analisar o papel deste proteoglicano em diferentes eventos como, proliferação, crescimento, controle do ciclo celular, adesão, apoptose, invasão celular e expressão de proteínas da via PI3K/AKT/mTOR realizamos o silenciamento gênico do sindecam-4 em células endoteliais resistentes ao anoikis utilizando a técnica de RNA de interferência (miRNA). Após o silenciamento gênico, observamos uma diminuição da expressão proteica e gênica do sindecam-4, acompanhada por uma redução do número de cadeias de heparam e condroitim sulfato no extrato celular e no meio de cultura. Os clones silenciados (miR-Syn-4-1-Adh1-EC e miR-Syn-4-2-Adh1-EC) apresentaram maior incorporação de BrdU após estímulo com soro, indicando que estas células se tornaram dependentes dos fatores de crescimento para proliferar, e menor taxa de crescimento. Em relação ao controle do ciclo celular, observamos uma diminuição no número de células na fase S. A capacidade adesiva ao colágeno foi significativamente maior nos clones silenciados, bem como apresentaram maior taxa de apoptose e menor taxa invasiva quando comparadas à célula endotelial parental (Adh1-EC). Os dados obtidos são similares aos encontrados para as células endoteliais selvagens (EC). A expressão de AKT, mTOR e PTEN, também foi investigada. Após silenciamento gênico do sindecam-4, observamos diminuição na expressão dos genes que codificam essas proteínas. Essa diminuição gênica não foi acompanhada pela diminuição da expressão proteica, exceto mTOR que apresentou uma redução, porém não significativa. Esses resultados nos levam a acreditar que o silenciamento gênico do sindecam-4 reverteu o comportamento tumorigênico das células resistentes ao anoikis. Essas e outras descobertas sugerem que o sindecam-4 é adequado para a intervenção farmacológica, fazendo deste um alvo atraente para a terapia do câncer.
  • Nenhuma Miniatura disponível
    Item
    Somente Metadadados
    Src kinase activation by nitric oxide promotes resistance to anoikis in tumour cell lines
    (Taylor & Francis Ltd, 2018) da Costa, Paulo E. [UNIFESP]; Batista, Wagner L. [UNIFESP]; Moraes, Miriam S.; Stern, Arnold; Monteiro, Hugo P. [UNIFESP]
    Tumour progression involves the establishment of tumour metastases at distant sites. Resistance to anoikis, a form of cell death that occurs when cells lose contact with the extracellular matrix and with neighbouring cells, is essential for metastases. NO has been associated with anoikis. NO treated HeLa cells and murine melanoma cells in suspension triggered a nitric oxide (NO)-Src kinase signalling circuitry that enabled resistance to anoikis. Two NO donors, sodium nitroprusside (SNP) (500 mu m) and DETANO (125 mu M), protected against cell death derived from detachment of a growth permissive surface (experimental anoikis). Under conditions of NO-mediated Src activation the following were observed: (a) down-regulation of the pro-apoptotic proteins Bim and cleaved caspase-3 and the cell surface protein, E-cadherin, (b) up-regulation of caveolin-1, and (c) the dissociation of cell aggregates formed when cells are detached from a growth permissive surface. Efficiency of reattachment of tumour cells in suspension and treated with different concentrations of an NO donor, was dependent on the NO concentration. These findings indicate that NO-activated Src kinase triggers a signalling circuitry that provides resistance to anoikis, and allows for metastases.
  • Imagem de Miniatura
    Item
    Acesso aberto (Open Access)
    Timp1 interacts with beta-1 integrin and CD63 along melanoma genesis and confers anoikis resistance by activating PI3-K signaling pathway independently of Akt phosphorylation
    (Biomed Central Ltd, 2013-03-25) Toricelli, Mariana [UNIFESP]; Melo, Fabiana H. M. [UNIFESP]; Peres, Giovani B. [UNIFESP]; Silva, Debora C. P.; Jasiulionis, Miriam G. [UNIFESP]; Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Ludwig Inst Canc Res
    Background: Anoikis resistance is one of the abilities acquired along tumor progression. This characteristic is associated with metastasis development, since tumorigenic cells must survive independently of cell-matrix interactions in this process. in our laboratory, it was developed a murine melanocyte malignant transformation model associated with a sustained stressful condition. After subjecting melan-a melanocytes to 1, 2, 3 and 4 cycles of anchorage impediment, anoikis resistant cells were established and named 1C, 2C, 3C and 4C, respectively. These cells showed altered morphology and PMA independent cell growth, but were not tumorigenic, corresponding to pre-malignant cells. After limiting dilution of 4C pre-malignant cells, melanoma cell lines with different characteristics were obtained. Previous data from our group showed that increased Timp1 expression correlated with anoikis-resistant phenotype. Timp1 was shown to confer anchorage-independent growth capability to melan-a melanocytes and render melanoma cells more aggressive when injected into mice. However, the mechanisms involved in anoikis regulation by Timp1 in tumorigenic cells are not clear yet.Methods: the beta 1-integrin and Timp1 expression were evaluated by Western blotting and CD63 protein expression by flow cytometry using specific antibodies. To analyze the interaction among Timp1, CD63 and beta 1-integrin, immunoprecipitation assays were performed, anoikis resistance capability was evaluated in the presence or not of the PI3-K inhibitors, Wortmannin and LY294002. Relative expression of TIMP1 and CD63 in human metastatic melanoma cells was analyzed by real time PCR.Results: Differential association among Timp1, CD63 and beta 1-integrins was observed in melan-a melanocytes, 4C pre-malignant melanocytes and 4C11- and 4C11+ melanoma cells. Timp1 present in conditioned medium of melanoma cells rendered melan-a melanocytes anoikis-resistant through PI3-K signaling pathway independently of Akt activation. in human melanoma cell lines, in which TIMP1 and beta-1 integrin were also found to be interacting, TIMP1 and CD63 levels together was shown to correlate significantly with colony formation capacity.Conclusions: Our results show that Timp1 is assembled in a supramolecular complex containing CD63 and beta 1-integrins along melanoma genesis and confers anoikis resistance by activating PI3-K signaling pathway, independently of Akt phosphorylation. in addition, our data point TIMP1, mainly together with CD63, as a potential biomarker of melanoma.